Protocole entraînement d'endurance et de performance Tests longitudinales pour Drosophila melanogaster

Nous décrivons le protocole première formation d'endurance pour une espèce importante du modèle génétiques, Drosophila melanogaster, Et de définir plusieurs tests pour tracer des améliorations en matière de formation suivant la mobilité.

Un des problèmes les plus urgents auxquels est confrontée modernes chercheurs en médecine est la flambée des niveaux d'obésité, avec l'augmentation conséquente de troubles associés tels que le diabète et les maladies cardiovasculaires ^1-3. Un sujet important de la recherche sur ces problèmes de santé associés implique le rôle de l'exercice d'endurance comme une intervention bénéfique.

L'entraînement physique est un moyen peu coûteux et non invasif d'intervention avec plusieurs résultats bénéfiques, y compris la réduction de l'excès de graisse dans le corps ^4, une sensibilité accrue d'insuline dans le muscle squelettique ^5, augmenté des réponses anti-inflammatoires et anti-oxydante ^6, et l'amélioration de la capacité contractile dans les cardiomyocytes ^7. Exercices de faible intensité est connue pour augmenter l'activité mitochondriale et la biogenèse chez les humains et les souris ^8, avec la transcription coactivateur PGC1-α comme un intermédiaire important ^9,10.

Despite l'importance de l'exercice comme un outil pour lutter contre plusieurs importantes maladies liées au vieillissement, de vastes études longitudinales génétiques ont été entravés par l'absence d'un protocole de formation d'endurance pour une espèce à vie courte du modèle génétiques. La variété des outils génétiques disponibles pour une utilisation avec la drosophile, conjointement avec son entretien durée de vie et peu coûteux à court, en font un modèle attractif pour une étude plus approfondie de ces mécanismes génétiques. C'est dans cet esprit que nous avons développé un nouvel appareil, connu sous le nom Power Tower, à grande échelle par l'exercice de formation chez Drosophila melanogaster ^11. Le Power Tower utilise le comportement des mouches instinctive géotaxie négative de façon répétitive induire rapide ascension. Chaque fois que les ascenseurs de la machine, puis descend, la plate-forme de mouches, les mouches sont amenés à monter. Les mouches continuent de répondre tant que la machine est en fonctionnement ou jusqu'à ce qu'ils deviennent trop fatigué pour répondre. Ainsi, le chercheur peut utiliser cette machine pour fournir sla formation imultaneous à un grand nombre de mouches appariés pour l'âge et génétiquement identiques. En outre, nous décrivons des tests associés utiles pour suivre les progrès longitudinal de cohortes de mouches pendant la formation.

1. Configuration Power Tower et le fonctionnement

1. Le Power Tower est placé sur un morceau rectangulaire de contreplaqué qui est serré à une table. A 4,5 vitesse rpm moteur de Grainger repose sur le dessus de quatre 2 "x6" conseils d'administration et du conseil d'administration contreplaqué une ¾ de pouce. Le moteur, une commande de vitesse AC / DC, un fusible, et une interrupteur marche / arrêt sont connectés ensemble dans une zone de jonction.
2. Pour refroidir le moteur, un 3 trous pouces de diamètre est découpée en une pièce verticale de ½ pouce de contreplaqué. Sur un côté, un ventilateur à 3 pouces est fixée à la contre-plaqué, et d'autre part, un cylindre de 3 pouces diamètre métallique est attachée.
3. Un bras de rotation sur mesure avec un rouleau monté sur l'extrémité est reliée au moteur. Le moteur et le bras joint tourner dans un sens horaire, poussant vers le bas d'un côté d'un stock courbée ¾ de pouce tube carré qui est attaché à l'contreplaqué avec une charnière de porte. Une roue est fixée à la face supérieure de la réserve de tube sous la plateforme pour lui permettre de rouler contre la plate-forme qui est directement dessus.
4. Le bras pousse vers le bas sur une extrémité de la réserve de tube et soulève l'extrémité opposée, portant une plate-forme à deux niveaux (figure 1D). Lorsque le rouleau sur le bras efface le stock de tube, il permet au bras de retourner à la position de départ, passant de la plate-forme vers le bas (figure 1E).
5. Les plates-formes se composent de supports qui sont placés sur le dessus de contre-plaqué et fixé par sandows qui sont accrochées sur les yeux vis. Les plates-formes glisser vers le haut et vers le bas le long curseurs tiroirs qui sont attachés à la contre-plaqué avec entre parenthèses.
6. Les flacons sont placés dans les racks et sécurisé par un écran grille carrée qui est maintenu en place par des cordons élastiques.
7. Un coussin en styromousse est placé en dessous la plate-forme pour amortir le choc de la chute.
8. La puissance du moteur est ajustée de telle sorte qu'une période complète de rotation est de 15 secondes.

2. Exercice protocole

1. Mouches sont logés dans un incubateur à 25 ° C avec une humidité de 50% et une lumière de 12 heures / dacycle de rk. L'entraînement physique et sur l'évaluation de la capacité d'exercice sont menées dans un 25 ° C de température ambiante contrôlée.
2. Les mouches sont collectées et appariés pour l'âge dans les 1-2 jours les uns des autres. Un minimum de 240 mouches est nécessaire pour le suivi longitudinal des géotaxie endurance et négatifs (escalade) capacité, deux indicateurs physiologiques qui reflètent les effets de l'entraînement physique. Suivi longitudinal permet d'isoler le changement induit par rapport aux valeurs de départ pour chaque cohorte, sans effets confondants de la variation entre les cohortes. Les mouches pour des expériences supplémentaires devraient être collectées selon les besoins.
3. Après la collecte, les mouches sont divisées en 120 mouches expérimentales, qui seront soumis au régime d'exercice, et 120 mouches de contrôle, qui ne seront pas exercés. Les mouches sont stockés dans des flacons de 20 vole chacun. Les flacons de mouches expérimentales sont bouchés avec Flugs fermes d'acétate de cellulose et les flacons de contrôle (non exercé) les mouches sont bouchés avec de doux spobouchons ESN, qui peuvent être poussés vers le bas pour immobiliser les mouches tandis que sur la Power Tower. Sponge est utilisé pour l'immobilisation parce que sa taille adaptative permet un positionnement facile à proximité du fond du flacon. Le matériau plus souple éponge réduit également les dommages causés par les Flugs plus solides.
4. Des mouches sur la Power Tower sont stockés dans des flacons et exercé qui contiennent 5 ml de nourriture, ce qui leur procure un atterrissage plus en douceur que les mouches qui sont exercées dans des flacons vides. La nourriture est généralement composé de saccharose à 10%, 10% de levure, et de l'agar 2% dans de l'eau, même si nous n'observons pas les mouches à manger souvent au cours d'une session de formation. Si les flacons vides sont utilisés pendant la formation, le pourcentage de mouches qui subissent des blessures est augmenté de façon spectaculaire.
5. Le Power Tower est exploité dans une pièce à température contrôlée qui est maintenue à 25 ° C. Mouches expérimentales sont placés sur la Power Tower et fait monter. Mouches de contrôle sont également mis sur le Power Tower, mais le bouchon éponge est pushed vers le bas dans le flacon d'environ 3 mm au-dessus des mouches afin de limiter le mouvement. Ce groupe sert de témoin pour tous les effets de la Power Tower qui sont sans rapport avec l'exercice. Bien que peu de place existe encore pour ces mouches de manœuvre, nous avons observé à plusieurs reprises que les mouches dans ces conditions de fonctionner très peu et ne démontrent pas une réponse physiologique à l'exercice. Il peut également être souhaitable d'inclure un groupe témoin qui n'est pas placée sur la Power Tower à tous.
6. Les mouches sont exercées cinq jours consécutifs chaque semaine, en utilisant un calendrier rampe (figure 2). Pendant une semaine les mouches sont exercés pendant 2 heures par session, pendant deux semaines, pendant 2,5 heures par session, et de trois semaines pendant 3 heures par session. Bien que d'autres traitements ont été testés, ce protocole donne des résultats cohérents à travers les génotypes et dans des conditions divergentes. Ce protocole est, cependant, l'objet d'un large éventail de variations possibles qui pourraient convenir à une expérience particulière.

1. Temps à la fatigue au cours de l'exercice d'endurance est un indicateur utile pour confirmer physiologique et / ou quantifier la capacité d'exercice d'une cohorte donnée. Dosages de fatigue peut être effectuée longitudinalement sur des cohortes qui seront utilisés dans des expériences de formation. Dosages peut être effectuée soit avant la formation, après l'achèvement du protocole de formation, ou les deux. Autres points dans le temps intermédiaires peuvent être ajoutés si la cartographie des progrès graduels au cours de formation est souhaitée. Le test de fatigue peut aussi être utilisé pour mesurer l'endurance physique comme une réponse à d'autres traitements que le protocole de formation, tels que l'altération alimentation (figure 3B).
2. Dosages de la fatigue devrait être menée sur un jour où la formation ne se déroule pas. Mouches à la fois le laboratoire et le contrôle sont placés sur la Power Tower dans des flacons de 20 chacun et fait monter jusqu'à la fatigue. La fatigue est reconnue comme l'absence de réponse à un stimulus négatif avec l'escalade géotaxie êtreportement. Comportement à la fatigue est marqué par l'observation visuelle.
3. Un flacon de mouches est considéré comme «fatigué» lorsque 5 ou moins les mouches sont capables de monter plus haut que 2 pouces pour les quatre baisses consécutives. Flacons fatigués sont retirés de la Power Tower alors qu'il est encore en activité, et le moment de l'enlèvement est enregistrée. Temps de retrait peuvent être tracées sous forme d'histogramme imbriqué, ou comme un "time-to-échec" complot. Un exemple de données les plus récentes en tant que "time-to-échec" complot est montré dans la figure 3B.
4. Les flacons sont surveillés à intervalles de 10 minutes pour un maximum de 10 heures (figure 3B).

4. Capacité d'exercice, l'âge et locomotrice

1. Depuis ce protocole de formation repose sur un comportement en cours d'exécution induite, un premier dosage pour la quantification de effets de la formation est de mesurer le changement longitudinalement en moyenne la vitesse de course pendant l'entraînement. Au cours de la formation, 120-mouche cohortes de mouches exercés et non levées sont testés quotidiennement pour leur réponse à un impact négatif géotaxie stimulus. La technique de l'anneau décrit dans Gargano et al. (2005) est utilisé pour mesurer la capacité des mouches d'escalade ^12. Brièvement, cette technique mesure hauteur moyenne est monté par un flacon de mouches pendant un temps défini après l'induction de géotaxie négative. La hauteur est monté pendant un temps défini est équivalente à la vitesse d'escalade. Les mesures sont effectuées avant de placer les mouches sur la machine pour un entraînement quotidien afin d'éviter les complications de la fatigue après l'exécution de la journée.
2. Dans notre protocole standard, les mouches sont exercés pour un total de trois semaines et la capacité d'escalade est examiné pour un total de cinq semaines: trois semaines au cours de l'exercice de formation et deux semaines après l'arrêt de l'exercice (figure 2). Cela permet à l'expérimentateur de tracer si les effets de l'exercice sur la mobilité persistent après l'arrêt du programme.
3. Quatre photographies de la performance de chaque cohorte RING quotidienne sont utilisés pour l'analyse de l'escalade capacité. Six flacons sont inclus dans chaque photographie. Négatif geotaxis est induite, et en utilisant une caméra à calage, une photographie est prise après un nombre défini de secondes. Nous utilisons généralement deux secondes, même si cela peut varier en fonction des conditions expérimentales. Pour chaque photographie, chaque flacon est divisé en quatre quadrants de hauteur égale, et le logiciel de traitement d'image est utilisé pour attribuer à chaque volée un score basé sur le quadrant il a atteint dans le délai imparti. Les mouches qui grimpent dans le quadrant le plus élevé reçoivent un score de 4, vole dans le quadrant le plus élevé suivant recevoir un 3, vole dans le quadrant deuxième rang recevront un 2, et les mouches dans le quadrant recevoir un plus bas 1. Les mouches qui ne sont pas grimper hors du fond du tout sont donné un score de 0.
4. Pour chaque flacon dans une photographie donnée, un «indice de l'escalade" est généré par la moyenne des notes de toutes les mouches dans ce flacon. Chaque fiole de indices des quatre photographies sont ensuite la moyenne pour donner un indice de l'escalade finale pour ce jour-là.
5. Toutes les expériences sont menées géotaxie négative longitudinalesdinally. Les résultats sont normalisés à l'initiale de "pré-exercice" score dans le but de réduire l'effet de la variation de cohorte dans l'escalade et la capacité de mettre en évidence la variation relative de la capacité d'escalade longitudinale d'une cohorte à la suite de l'entraînement physique. Le score initial est déterminé par la moyenne des indices des trois premiers jours de l'escalade et se voit attribuer une valeur de 1. Des essais ultérieurs sont ensuite exprimés en pourcentage de l'indice initial.

5. Les résultats représentatifs

Wild-mouches de type répondent à un protocole d'endurance avec une diminution liée à l'âge diminution de la capacité d'escalade qui persiste après la fin de la formation, comme en témoignent des essais RING longitudinales sur les cinq semaines d'âge (figure 3A). Cette baisse retard dans géotaxie négative est une réponse standard phénotypique qui peut servir de contrôle positif afin d'assurer que la réponse de l'exercice de type sauvage qui se passe normalement. Cet ensemble de données est présenté comme un exemple de la façon dont lel'induction de l'exercice par le programme Power Tower peut être utilisé comme une entrée de comportement. La capacité des différents facteurs génétiques ou environnementaux pour moduler cet effet peut alors être évaluée.

A l'inverse, la Power Tower peut également être utilisé comme une sortie dans divers modèles expérimentaux. Par exemple, le génotype, le régime alimentaire, ou d'autres conditions peuvent être modifiées. Ensuite, l'effet de ces variations sur physiologie de l'exercice peut être testée à l'aide de la Power Tower. Ici, nous montrons un exemple de cette approche. Lorsque vole avec un pourcentage variant de saccharose dans leur alimentation ont été testés pour le temps de la fatigue, augmentation de la teneur en saccharose en corrélation avec la capacité d'endurance accrue (figure 3B).

Figure 1. Le fonctionnement de la Power Tower. (AC) Le bras plié avec le rouleau motorisé joint tourne en sens horaire jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le tube coudé carré. (D, E) Lebras pousse vers le bas sur le tube coudé carré, ce qui provoque la plate-forme qui est chargé de flacons de mouches à lever. (F) Comme le bras efface le tube de la plate-forme est autorisé à se replier vers le bas, forçant les mouches pour revenir à la partie inférieure de la flacon.

Figure 2. Suggérée Protocole exercice. Mouches soumis au protocole de formation sont faits pour exercer pendant cinq jours par semaine en vertu d'un régime de trois semaines rampe longue qui augmente progressivement la durée de l'exercice des 2 premières heures de 30 minutes chaque semaine. Les analyses standard comprennent des essais de fatigue avant et après le programme d'exercices et des tests de la semaine 1 RING jusqu'à la semaine 5. Tous les tests sont effectués en double exemplaire sur un nombre égal de mouches non levées comme un contrôle négatif. Autres divers tests physiologiques ou biochimiques peuvent être effectuées tel que déterminé par le chercheur.

Figure 3. Les exercices d'endurance modifie les multiples aspects de la mobilité. (A) des dosages effectués RING longitudinalement à travers les âges dans une seule paire de mâles Y ¹ W ^67C23 cohortes. Appariés pour l'âge, génétiquement identiques et les mouches de contrôle exercé non exercées ont été mesurées quotidiennement pour la vitesse moyenne de l'escalade. Les résultats sont exprimés en termes d'un indice d'escalade qui est normalisée à la taille moyenne d'escalade dans les trois premiers jours de mesure. Exercice formés mouches affiché une diminution liée à l'âge diminution de la capacité géotaxie négative par rapport à appariés pour l'âge frères et sœurs non exercées à travers les âges (2-way ANOVA, p <0,005). (B) des essais de fatigue menée pendant 8 heures sur appariés pour l'âge des mouches femelles Canton S montrent un effet significatif de la teneur en saccharose alimentaire sur le temps de la fatigue (log-rank, p <0,0001). Avant d'expérimenter, les mouches ont été nourris avec un régime de levure / saccharose / agar-agar, avec un poids de 10% / volume ouiconcentration er, et un pourcentage variant de saccharose alimentaire. Cinq flacons de 20 mouches chacune ont été testés pour chaque régime. Graphique affiche le nombre de flacons ont encore cinq ou plus des mouches en cours d'exécution à un moment donné. Ces résultats peuvent être traitées statistiquement et graphiquement comme une survivance (ou le temps à l'échec) la courbe, avec «échec» pour un flacon étant défini comme un point dans le temps où moins de cinq mouches continuent de répondre à un stimulus géotaxie négative. Notez que de nombreux autres modèles d'étude possibles et les traitements statistiques sont possibles, et le traitement des données et de mesure doivent être adaptés à des fins individuelles.

Le protocole général présenté ici a réussi à documenter les effets physiologiques qui suivent une formation. Toutefois, plusieurs domaines de ce protocole sont sujettes à modification en fonction des besoins particuliers expérimentales. Par exemple, la durée de la formation et le nombre de combats pourrait être modifiée pour rendre le programme plus ou moins difficile, comme vous le souhaitez. La hauteur du conteneur dans lequel la capacité est mesurée géotaxie négative pourrait être modifiée pour augmenter la surface disponible pour l'amélioration doit être documenté. Diverses méthodes d'automatisation de la quantification de la vitesse de montée peut également être applicable. En principe, n'importe quel logiciel capable de distinguer une mouche de fond peut être utilisée pour accélérer le processus de collecte des données.

Certains aspects du protocole devrait être modifiée qu'avec une grande prudence, cependant. Par exemple, des expériences préliminaires indiquent fortement que au moins un jour de repos par semaine tend à favoriser une plus grande imprOUVEMENT que l'exercice quotidien implacable. En outre, les rythmes circadiens de la température et sont connus pour affecter la circulation des animaux à sang froid. Le moment de la journée que la formation a lieu peut être modifiée, mais doit toujours être conforme au sein de groupes particuliers en vertu de comparaison, afin d'éviter la possibilité d'effets confondants des rythmes circadiens. Contrôle de la température est également essentiel, et nous recommandons une salle dédiée à la température constante à l'équipement d'exercice maison. Enfin, les mâles et les femelles doivent être élevés et mesurées séparément, afin d'éviter le risque d'effets confondants de différences de fécondité et le sexe dans la capacité d'exercice.

Les applications potentielles de cette méthodologie sont limitées que par l'imagination du chercheur. Dans un travail préliminaire, nous avons utilisé cette méthodologie en trois applications principales:

1. Pour mesurer l'effet de l'exercice d'endurance sur différents aspects de la biologie de type sauvage à travers les âges.
2. To mesurer l'effet de l'exercice d'endurance sur certains phénotypes mutants.
3. Pour dépister les facteurs génétiques qui sont nécessaires pour exécuter les bienfaits de l'exercice

Chacune de ces applications englobe un large éventail de possibilités spécifiques. Basé sur notre expérience préliminaire, phénotypes mutants ont tendance à varier avec le niveau d'exercice autant qu'ils varient avec le régime. L'utilisation de modèles d'invertébrés afin de mieux comprendre la relation entre l'alimentation, l'exercice, et de la physiologie du vieillissement est peut-être l'application générale la plus importante de ce protocole.

Je n'ai rien à communiquer.

Ce travail a été soutenu par une subvention du NHLBI pour RW.