Method Article
Tuvar dokuların çok sayıda eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Dokuların Temsilcisi parçaları tek bir parafin blok içine monte edilir. Bloktan bölümleri proteini ifade kalıpların immünhistokimya ve analiz için kullanılır. Dijital tarama veri dağıtımı için ilgili görüntüler oluşturur.
Doku mikroarray (TMA) teknolojisi, birden fazla doku ve hücrelerin yüksek verimlilik analizi için araçlar sağlar. Normal insan dokularında tekniği, kanser hücresi hatlarında ve protein salgılanma modellerini küresel analizi için insan proteini Atlas proje içinde kullanılmaktadır. Burada tek bir alıcı TMA blok içine mikroskopik olarak seçilmiş temsili dokulardan alınan 1 mm çekirdek montaj, sunuyoruz. Bir TMA blokta çekirdek sayısı ve büyüklüğü 0.6 mm çekirdek yüzlerce yaklaşık kırk 2 mm çekirdeklerinden değiştirilebilir. TMA teknolojisi kullanılarak bir avantajı verilerin bu büyük miktarda hızla deney değişkenliği önlemek için, tek bir immun protokol kullanılarak elde edilebilir. Önemli olarak, nadir doku sadece sınırlı bir miktarda hastaya büyük kusaklardaki analizi 1 2 olanak sağlayan, ihtiyaç duyulmaktadır. Yaklaşık olarak 250 ardışık bölümleri (kalın 4 mikron) bir TMA blok kesilmiş ve immünhistokimyasal staini için kullanılabilir250 farklı antikorları spesifik protein ekspresyonu belirlemek için ng. İnsan Protein Atlas proje içinde, bütün insan antikorları proteinleri doğru oluşturulur ve insan kanser 20 en yaygın formları temsil eden 216, farklı hastalar, 144 bireyler ve kanserli hem de dokulardan Normal insan dokularında karşılık gelen protein profilleri elde etmek için kullanılır. Cam lamlara İmmunohistokimyasal lekeli TMA bölümleri patologlar yorumlamak ve immünhistokimya sonuçlarının açıklama olabilir hangi yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için taranır. Araya gelen patoloji tabanlı açıklama verilerle Görüntüler İnsan Protein Atlas portalı (aracılığıyla araştırma toplumu için kamuya yapılan www.proteinatlas.org ) (Şekil 1) 3 4. İnsan Protein Atlas insan vücudunda dağıtım ve proteinlerin göreceli bolluk gösteren bir harita sunar. Mevcut verMisyonu ise, insan genomu tarafından kodlanan tüm proteinlerin fazla% 61'e karşılık gelen 12,238 eşsiz protein, protein ifade verileri ile 11 milyon görüntüleri içerir.
1. Doku Mikroarray Üretim için dokular nasıl hazırlanır (Animasyon 1)
2. Manuel Doku Mikroarray Üretim (çekim için Temel)
3. Nasıl Bölüm TMAlar (Animasyon 2)
4. Test ve İmmünohistokimya için Titrasyon Prosedürü (Animasyon 3)
Her bir antikor doku ve farklı hücre tipleri bir karışımını içeren özel olarak tasarlanmış TMAlar kullanılarak standart bir test prosedürü tabi tutulur. Amaç her antikor için bireysel ve optimize immun protokolü değerlendirmektir. Karınca dayalı Başlangıçta bir seyreltme,Primer antikor ibody stok konsantrasyonları test edilir. Bu test boyamanın sonucu protokol daha dilüsyonları ve optimizasyon yönlendirmek için kullanılır.
5.. Boyama Programı, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)
Bütün inkübasyonlar, RT gerçekleştirilir ve bu protokol aynı reaktifleri ile manuel bir ayar olarak da kullanılabilir.
Tüm reaktifler slayt başına 300 ul bir ses seviyesinde uygulanır.
* Adımlar 10-14 bir histostaining enstrüman (Autostainer XL, Leica) yapılır ve coverslipping ayrıca bir coverslipper sistemi (otomatik cam coverslipper CV5030, Leica) yapılır.
6. Tarama nasılBir Slayt
Tarama slayt yöntemi kullanılmaktadır dijital tarayıcı bağlıdır, bu protokolü sadece otomatik tarama sistemi Aperio XT (Aperio Teknolojileri) kullanarak slayt tarama nasıl tanımlar. Için İnsan Protein Atlas set-up 20x büyütme, doku ve hücreler için 40x kullanılır. Otomatik bir tarama doku heterojen bir TMA dahil çeşitli dokularda sayısına bağlı olarak odak sorunlarla olabilir.
7. Nasıl İnsan Protein Atlas Sık Protein ara ile
8. Temsilcisi Sonuçlar
Animasyon 1. Nasıl doku mikroarray üretimi için dokuların hazırlanması. Animasyon 1 görmek için buraya tıklayın .
Animasyon 2. Nasıl bölümüne TMAlar için. Animasyon 2 görmek için buraya tıklayın .
Animasyon 3. Immünhistokimya tekniği tarif edilmiştir. Animasyon 3 görmek için buraya tıklayın .
Şekil 1. Insan proteini Atlas Uppsala içinde işlemi Genel şeması.
Doku çekirdek standart uzunluğu için işaretlenmiş Şekil 2. Donör stileyi 4.5 mm gibi.
Şekil 3. Manuel doku microarrayer.
Şekil 4. Üretilen TMAlar farklı kalite örnekleri. (A) düz ve düzgün satır ve sütun gibi parafin kenarına arasında yeterli boşluk ile TMA hizalanır. (B) çekirdek bazıları ile bir TMA çok kesit zaman olası güçlüklere yol kenarına yakın. (C) bir TMA t pişirilir edilmiş olduğuoo uzun doğru şablonu olmadan çökmüş TMA sonuçlanır.
Şekil 5. Hematoksilen ve eozin TMAlar. Düz ve hizalı sütun ve satır ile (A) düzgün kesilmiş bölümü. Kötü ya da kirli bıçak kullanarak yarma (B) veya sıkıştırılmış bölümleri (C) neden olabilir.
Şekil 6. Antikorların titrasyon. (A) lenf düğümü hücreleri Reaksiyon merkezi geçmişi olmayan özel bir sitoplazmik boyanması (kahverengi gösterildiği gibi) ile sonuçlanan bir optimum titre antikoru gösterir. (B) doku bölümü zayıf bir boyama gösterir. Negatif ya da zayıf bir boyama primer antikorun konsantrasyonunu hedef protein immunohistokimyasal dokularda mevcut değildir çok düşük olduğunda veya bulunur. (C) doku bölümü primer antikorun çok yüksek konsantrasyonda kullanılması nedeniyle overstained edilir. D, taşmak reaktivite ve yanlış pozitiflik geçmeye nedeniyle Subselüler yerini belirlemede zorluklar içinde gemi renk sonuçlar.
İmmünohistokimya tarafından bugüne kadar TMAlar için en sık kullanılan bir uygulamadır. IHC ve TMAlar kombinasyonu 11 12 ve daha fazla bazik tümör biyolojisi geniş bir hasta kohortlarında doku örnekleri dayalı dokularda protein ifadesini 7 8 kalıpları ve hücreler 10 9, belirteç buluş çalışmaların örneğin yüksek verimli tarama teknikleri, birkaç farklı ayar kullanılabilmektedir farklı fenotipleri / genotipleri, farklılaşma aşamaları, ilerleme ve metastazı 13 de dahil olmak üzere çalışmalar. TMAlar kullanmanın bir avantajı, büyük kohort malzeme hem de değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlanması ve daha tekrarlanabilir deneyler, bir anda analiz edilebilir. Ayrıca, TMA teknoloji kullanımı reaktif maliyetlerini ve laboratuvar işlem zamandan tasarruf sağlanır. Bir TMA sadece bir doku sınırlı miktarda içerdiğinden, doku heterojen bir konudur. Doku ve ele alınması gereken soru türüne bağlı olarak, birkaç örnek aynı specime gelen gerekebilirn. Bütün bu doku bölümlerini 13 14 temsili doğruluğu, yüksek derecede neden olduğu gösterilmiştir olarak tümör dokuları için, her örnek 2-4 çekirdek kullanılması tavsiye edilir. Doku bileşimine bağlı olarak delgeçler (0.6 mm ila 2 mm kadar) ve çapı ayarlanabilir. Dokular karmaşık ve hem de birkaç farklı hücre tipleri, yapıları ve ekstraselüler matriks vardır. Yağ değişken miktarda içeren her farklı doku tipi kompozisyonu, kan damarları, bağ dokusu, kıkırdak dokusu gibi, ayrı çekirdek delme ve toplanması için gerekli basınç etkileyecektir. Bu deneyler için amaçlanan tanımlandığı dokuları ile TMA üretiminde daha önce, herhangi bir değer olmayan malzeme üzerine prosedürü tüm adımları uygulamaya önem taşımaktadır.
Bir TMA blok içinde farklı dokularda çeşitli kesitler zaman blok kompozisyonu yüksek kalite bölümleri kazanmak yeteneğini etkileyebilir. Certain dokular, örneğin deri, kemik iliği, yağ, beyin ve meme, bölümleri su banyosunda germek nasıl etkileyen doku farklılıkları etkisi nedeniyle zor TMA blok kesit ve nasıl farklı sertlik vermekteyiz bıçak vb tarafından kesilir uygulanabildiği takdirde Dolayısıyla benzer özelliklere sahip grup dokulara tavsiye edilir, bir TMA içine yağ bakımından zengin doku gibi. Kanser dokularının çoğunda bu anlamda homojen, hangi kanser TMAlar bir kesit kolaylaştırır. Dokular heterojen türleri ile TMA tutarken mikroarray çekirdeği stabilize edilmesi için alternatif bir kesit yöntemi uygulanabilir. Bir yapışkan bant kullanımı kesitli TMA çekirdek ve fall-out kaybı önlemek için yararlı olabilir. Bant kesitli çekirdek kalınlığı etkileyen ve daha sonra da İHK boyama 15 sonuç çünkü yapışkan bant kullanımı, dikkatli kullanılmalıdır. 9x8 İnsan Protein Atlas set-up bir TMA şablonu (işaretleri hariç) çekirdek are kullanılabilir. Bu bölümden maksimal numarası almak ve blok boyunca temsil edilen bütün dokulara tutmak için önemlidir. Reaktifler ve tarama zamanı kaydetmek için, 2 gözlü 9x8 maksimum şablon sağlayan bir cam slayt yerleştirilir.
Protein bilgi için büyük deposu, Universal Protein Resource 16 sadece yaklaşık% 66 protein düzeyinde kanıta sahip olan yaklaşık 20.300 yorumlanan insan proteini girişlerini içerir. Ayrıca protein düzeyi üzerindeki varlığını kanıt olduğu genlerin bir çoğunluğu için, kıt veya protein fonksiyonu ve ifade dağıtımı konusunda herhangi bir bilgi yoktur. Gelecek için önemli bir zorluk dağılımı ve insan dokusu, çok çeşitli şekillerde bu bilinmeyen proteinlerin göreceli bolluk analiz etmektir. Böyle Uniprot, Ensemble'da, PubMed yayımlanan veri olarak veritabanlarından bilgi immünohistokimyasal boyanma antikorları kullanarak eğer kurmak için bir kılavuz olarak kullanılabilirservislerinde bilinmeyen proteinleri amaçlanan hedef protein fiili proteini profilleri temsil eder. Ayrıca, diğer bazı doğrulama stratejileri protein dizileri, Western Blot, immünfloresan, immüno-yağış ve açılan deneylerde Örneğin antikor işlevsellik için, antikor işlevselliği sağlamak için gereklidir. Belki antikor işlevselliği doğrulama için en önemli araç eşleştirilmiş antikorlar kullanmak, yani iki farklı antikor testi-spesifik sonuç 17 karşılaştırmak için, aynı hedef proteini ayrı, örtüşmeyen epitoplara kaldırdı.
Derlenen bilgilere göre, antikorlar IHC standartları ve İnsan Protein Atlas projesinde 35.000 antikorlar üzerinde test edilmesi ve tanınması gelen deneyim göre test edilmiş ve titre edilir. Protein profilleri ile tüm genlerin% 20'den, eşleştirilmiş antikorlar (aynı protein örtüşmeyen epitopları doğru 2 veya daha fazla antikor) veri en iyi Esti belirlemek için kullanılmıştırgelen protein ifade deseninin dostum. Eşleştirilmiş antikorlar özel immünhistokimya bazlı protein ekspresyonu doğrulanması için nihai bir strateji sunmak. Temel tarama dahil farklı dokuların çok sayıda çapraz reaksiyon riskini artırır, çünkü bu strateji değerlidir. Bu belli dokularda genel olarak örneğin makrofajlar, düz kas, böbrek distal tübüller ve karaciğerde hepatositlerde boyama arka plan göstermek için daha fazla eğilimli olduğu da unutulmamalıdır. Yanlış negatif ya da uygunsuz pozitif IHK boyanma neden olabilir arşiv malzemesi alınan dokular için zamanla doku işleme teknikleri farklılıklar, düşünülmesi gereken ek sorunları. Bu olgu, aynı zamanda büyük bir bölümü analiz görülür. Hem negatif hem pozitif kontroller çok önemlidir ve mümkün olduğunda kullanılmalıdır. İlgili tr fonksiyonel analiz, zorla ifade ile hücre hatları ve özel knock-down gibi derin çalışmalar içinanscripts (siRNA teknolojisi) denetimler oluşturmak için kullanılabilir. Formalin fiksasyonu çeşitli kimyasal değişiklikler, çapraz bağlama antijen 18 maskeleme Schiff bazları hidroliz gibi indükler yana IHC optimum sonuçlar için, bu, antijen alma sistemleri test etmek ve kullanmak önemlidir.
Sonuç olarak, TMA teknolojisi ve IHC kullanıldığı antikor bazlı proteomiks büyük bir ölçekte proteini ifade verilerinin üretilmesi için güçlü bir strateji. İnsan Protein Atlas projesi normal insan dokularının ve kanser insan protein ekspresyonunda bir harita oluşturmak için kurulmuştur. Bu projenin amacı, 2015 yılında kapsamlı bir İnsan Protein Atlas ilk taslağını sunmak. Normal organ ve dokularda protein profilleri sağlamanın yanı sıra, bu çaba da klinik biyomarker bulma çabaları da dahil olmak üzere biyomedikal araştırma projeleri için bir başlangıç noktası sağlar. Nihai hedef, insan genom dizisi üstüne bir sonraki bilgi katmanı eklemek olduğunu wiçeşitli hastalık durumları altta yatan biyolojinin daha derin bir anlayış için çok önemli olacak ve yeni tanı ve tedavi araçları geliştirmek için bir temel teşkil edeceğiz.
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Bu çalışma Knut ve Alice Wallenberg temelden bağışları ile desteklenmiştir. Uppsala, Stockholm ve Hindistan İnsan Protein Atlas merkezlerinin tüm kurmayları İnsan Protein Atlas oluşturmak için çabaları için kabul edilmiştir. Çekerken, yazarlar, özellikle TMA üretimi ile yardım için fotoğraf ve Elene Karlberg yardım için Frank Hammar ve Sofie Gustafsson teşekkür etmek istiyorum.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
Tampon yıkayın | Thermo Fisher Scientific | TA-999-TT | |
Tampon PH6 sitrat | Thermo Fisher Scientific | TA-250-Pm1X | |
Antikor seyreltici | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UD | |
UltraVision LP HRP polimer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-HL | |
DAB artı substrat sistemi | Thermo Fisher Scientific | TA-125-HDX | |
Ultra V Blok | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UB | |
İlköğretim Antikor Enhancer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-PB | |
Mayers hematoksilen | Histolab | 01820 | |
PERTEX | Histolab | 00871.0500 | |
Ekipman Adı | Şirket | Katalog numarası | |
Manuel doku mikro arrayer | Estigen, Beecher Enstrüman | MTA-1 | |
Şelale mikrotom | Thermo Fisher Scientific | Microm HM 355S | |
Otomatik görüntü tarayıcı | Aperio Teknolojileri | XT | |
Otomatik slayt boyama sistemi | Thermo Fisher Scientific | Autostainer 480S-2D | |
Deparafinizasyon ve dehidrasyon için otomatik slayt boyama sistemi | Leica Biyosistem | Autostainer XL | |
Otomatik cam coverslipper | Leica Biosystems | CV5030 | |
Decloaking odası | Biocare Tıp | DC2008INTEL |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır