Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Bu tümör hipoksi malign ilerlemesini teşvik ve terapötik yanıt olumsuz etkileyen önemli bir rol oynadığı kabul edilmektedir. Bu, derin yerleşimli ortotopik tümörlerin izlemek için verimli bir anlamı olmaması nedeniyle, kötü huylu beyin tümörleri intrakraniyal gelişimi sırasında in vivo, tümör hipoksi in situ hakkında az bilgi vardır. Lusiferaz gen ifade canlı hücreler tarafından yayılan ışık algılama dayalı Biyoparlaklık görüntüleme (BLI), preklinik hayvan çalışmalarında tedaviye yanıt olarak tümör büyüme ya da tümör boyutu değişiklikleri değerlendirmek için, hızla, özellikle, kanser araştırmaları için kabul edilmiştir. Ayrıca, bir muhabir gen promotor dizisinde kontrol altında ifade ederek, belirli bir gen ekspresyonu BLI tarafından non-invaziv takip edilebilir. Hipoksik stres altında, sinyal yanıtları ağırlıklı olarak hipoksi indüklenebilir faktör 1α (HIF-1α) aracılığıyla çeşitli genlerin transkripsiyon sürücü. Bu nedenle, stably insan meme kanseri MDA-MB231 hücreleri (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc) in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil yapılır transfekte HIF-1α muhabiri inşa 5HRE-ODD-luc, normoxia hücrelerin (% 21 O ₂₎ bir kontrol olarak hizmet ederken, BLI 24 saat önce hipoksik odası (% 0.1 O ₂₎ transfekte hücreler kuluçka. Hipoksi altında hücreler için gözlenen anlamlı olarak daha yüksek foton akısı, organizatörü normoxia içinde olanlara oranla bir artış HIF-1α bağlanma (HRE elemanları), göstermektedir. Hücreler bir meme kanseri beyin metastazı modeli kurmak için doğrudan fare beyninin içine enjekte edilir, in vivo tümör hipoksi dinamikleri biyoparlaklık görüntüleme implantasyon sonrası 2 hafta başlatılan ve haftada bir kez tekrarlanır . BLI artmış intrakraniyal tümör hipoksi gösteren, beyin tümör ilerledikçe artan ışık sinyalleri ortaya koymaktadır. Histolojik ve immünhistokimyasal çalışmalar in vivo görüntüleme sonuçları onaylamak için kullanılır. Burada, in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil, intrakranial tümör hipoksi izlemek için in vivo biyoparlaklık görüntülemede bir çıplak fare ve uygulama bir meme kanseri beyin metastazı cerrahi kurulması yaklaşımları tanıtacak.

Bütün hayvan prosedürleri Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1 in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil

1. Gereç ve Yöntem:
   • İnsan metastatik meme kanserli hücre hattı MDA-MB231, HIF-1-bağımlı bir roman muhabiri geni ile transfekte, 5HRE-ODD-luc Dr. Harada tarafından üretildi.
   • Hipoksik durum, gelişmiş, oksijen bağımlı bozulması etki alanı (ODD) Lusiferaz füzyon proteini ifade hipoksi-yanıt elemanı 5 kopyaya (5HRE) tarafından tahrik edilir. ODD varlığı normoksik koşullarında son derece düşük arka plan luciferase aktivitesi ile sonuçlanan ODD-Luc protein bozulmasına neden olur. Bu nedenle, bu yeni sistem, gerçek zamanlı görüntüleme ile bir tümör hipoksik bölgeleri tespit etmek için kullanılabilir. Harada ve ark ^1,2 ile inşaat 5HRE-ODD-luc ifade vektör bildirilmiştir.
2. Kültür normoxia veya hipoksi altında hücreleri:
   • % 10 fetal sığır serumu (FBS)-DMEM orta% 1 glutamin, 400 mikrogram / ml G418 antibiyotik ve% 1 penisilin / streptomisin içeren rekombinant MDA-MB231 hücreleri koruyun.
   • In vitro HIF-1α biyoparlaklık deneyi, plaka 3 x 10 5HRE-ODD-luc vektör her iki altı iyi yemeğin iyi ifade ⁵ MDA-MB231 hücreleri.
   • Normoksik durum (% 21 O ₂₎ altında diğer çanak tutmak hücreleri, gecelik inkübasyondan sonra çanak duvara takın ve daha sonra hipoksi hipoksi çalışmaları için bir odası (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) içine bir çanak transferi için izin verin .
   • % 0.1 O ₂ oda ve gaz odasına bir gaz silindiri ile giriş deliği boru bağlayarak monte edin.
     Not: Bu işlem sırasında her ikisi de giriş ve çıkış bağlantı noktası kelepçeler açık olmalıdır.
   • Plastik kelepçeler kapatarak tasfiye kamara ve sızdırmazlık odaları olmuştur sonra gaz kaynağı bağlantısını kesin.
   • % 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör odasına yerleştirin.
     Not: odasına kültürlerin aşırı buharlaşma önlemek için nemlendirilmiş olmalıdır. - 20 ml steril su odasında 10 yerleştirerek başarılı olabilir.
3. Biyoparlaklık tahlil:
   • 24 saat inkübasyondan sonra, orta çıkarın ve buz PBS (2X) ile hücrelerin hızlı bir şekilde yıkayın.
   • 100 ul luciferase (Altın Biyoteknoloji, St Louis, MO), soğuk PBS 1 ml ekleyin.
   • (1, 30, 60, 180 s) farklı pozlama süreleri ile BL görüntüleme (IVIS Spektrum sistemi, kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) edinin.
   • Her Yaşayan Image yazılımı (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün.

2. Bir meme kanseri beyin metastazı model oluşturulması

1. MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücrelerin hazırlanması
   • % 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Deme orta MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücreleri almak ve kültür.
   • 2-3 günde bir orta değiştirin. Tripsinize ve% 80 izdiham ulaştığınızda hücreleri yıkayın.
   • Uygun sayıda hücre sayımı ve serum serbest Deme orta 4 ul hacmi 10 ⁵ hücre nihai bir konsantrasyon ile% 25 Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) ile tekrar süspansiyon haline getirin.
   • Intrakranial enjeksiyon öncesinde buz üzerine yerleştirin hücreleri.
2. Cerrahi implantasyon
   • Bu çalışmada Bayan çıplak farelerin (BALB / c nu / nu, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD) eski 4-6 hafta kullanılır.
   • Anestezisi (indüksiyon odasında O2 / izofluran% 3, Baxter International Inc, Deerfield, IL, ABD izofluran) ve oksijen (1 dm ³ / dak) izofluran (% 1), cerrahi ^işlem 3 sırasında hayvanları korumak .
   • Sağ parietal cilt betadin ve sonra insizyon öncesi% 70 alkol ile prepped olmalıdır.
   • Yüksek devirli kullanarak, çapak, kafatası, 1mm ön sağ yarımkürede koronal sütür ve saggital dikiş lateral 2 mm 1 mm delik.
   • 4 ul hücre karışımı (10 ⁵ hücreleri) 10 ul Hamilton şırınga (Hamilton Company, Reno, NV) kullanarak çizin. Hücreleri doğrudan sağ kaudal diensefalon, ısmarlama bir 32G Hamilton iğne kullanarak duramater altında 1,5 mm içine enjekte edilir. Çekilme önce yaklaşık 30 iğne tutun. 32G ince iğne kullanımı, doku hasarı en aza indirir.
   • Burr hole kemik balmumu ile doldurun ve kafa derisi emilebilir dikişlerle yakın.
   • % 70 alkol ile kesi bölgesi hazırlayın.
   • Buprenorfin analjezi iki gün boyunca her 12 saat uygulayın.

3, meme kanseri beyin metastazı tümör hipoksi dinamikleri in vivo biyoparlaklık görüntüleme

• 8 haftada bir kez intrakranial implantasyon ve tekrar sonra uzunlamasına biyoparlaklık görüntüleme başlatın (IVIS Spektrum sistemi) iki hafta-10 Hafta.
• Bir seferde üç fareler anestezi (% 3 O ₂ / indüksiyon odasında izofluran)
• Daha önce ⁴ ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her bir fare boyun bölgesinde subkutan D-luciferase (Altın Biyoteknoloji 120 mg / kg toplam hacminin 80 ul PBS) Yönetici bir çözüm .

D-luciferase non-toksik ve sağlam kan-beyin bariyeri (KBB) ve hücre zarlarının ^3,5 etme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir .

• Görüntüleme odasında 3 fareler yerleştirin ve görüntüleme sırasında oksijen (1 dm ³ / dak) izofluran (% 1) ile korunur.
• Beş dakika luciferase enjeksiyon sonra, bir dizi çeşitli pozlama süresi (1, 30, 60, 180 s) BL görüntüleme kazanır.

Gözlemlerimiz tepe ışık yayma süresi boyun bölge ^3,4 luciferase subkutan uygulamadan sonra yaklaşık 5 dakika olduğunu gösteriyor.

• Living Görüntüleme yazılımı (Kaliper Yaşam Bilimleri) ile ilgi bir bölgede mutlak foton sayısı (fotonlar / s) kullanarak verileri analiz (ROI), beyin BLI sinyal anahat elle çizilmiş.
• Foton sayıları Arsa zaman içerisinde eğrisi tümör hipoksi dinamiği göstermek için.
• Son BLI hemen sonra, pimonidazole, hipoksi marker ve daha sonra 1 saat yönetmek fareler kurban ve beyinleri teşrih. Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta ve donma -80 ° C derin dondurucu bütün beyinleri gömün. Daha sonraki histolojik kresil violet boyama ve lucifeares, hipoksi işaretleyici pimonidazole karşı immünohistokimyasal ve HIF-1α görüntüleme gözlemlerini doğrulamak için yapılır.

4. Temsilcisi sonuçları:

Şekil 1'de gösterildiği gibi, önemli ölçüde daha yüksek BLI sinyal, 24 saat hipoksik odası (% 1 _O 2) inkübe transfekte hücreler sonra gözlenmiştir. Zayıf ışık yayma normoxia altında kontrol hücreleri gözlendi. Bu, hücrelere bir stres sinyali HIF-1α eksprese uyarılan 3 x ⁵ 10 hücreleri, 24 saat kültürden sonra kalabalık hücre popülasyonu sonucu olabilir . Bununla birlikte, in vivo BLI sonuçları immünohistokimyasal boyama ile tümör hipoksi ve lusiferaz ifade arasındaki ko gösteren onaylandı .

Pozlama süreleri otomatik bir dizi uzun pozlama süresi ile zayıf bir sinyal yakalama kolaylaştırır dizi görüntüleri, doyurarak CCD olmadan kısa bir süre kullanarak güçlü sinyaller sürekli alımlar sağlar.

In vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil Şekil 1. sıra: 24 hipoksi bir odasında 6-iyi çanak (% 0.1 O ₂₎ her bir kuyunun içinde inkübe, 3 x ¹⁰ 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücreleri saat orta önce kaldırılır yıkanmış ve 1 ml PBS ile değiştirilir. 100 ul luciferase her kuyuya eklendi hemen sonra, BLI maruz kez bir dizi (1, 30, 60, 180 s) elde edildi. Güçlü lüminesans temsilcisi kuyulardan gözlendi Alt satır: Kontrol olarak, 3 x 10 ⁵ hücre normoxia (% 21 O ₂₎ zayıf ışık yaydığı altında inkübe.

In vivo tümör hipoksi dinamikleri biyoparlaklık görüntüleme Şekil 2 A) fare beynin sağ tarafında zayıf ışık sinyali MDA-MB231/5HRE-ODD-luc meme kanseri hücrelerinin intrakranial implantasyonu ilk görüntülenmiştir 5 hafta sonra. Artan optik sinyal, ek 6 hafta içinde artan tümör hipoksi belirten gözlendi B) arsa, ışık sinyali kantitatif foton sayımı zaman ders eğrisi gösterdi .

Şekil 3 ve immun boyama ile kimyasal boyama tespit hipoksi lusiferaz Colocaliztion OCT gömülü bir metastaz meme kanseri MDA-MB231/5HRE-ODD-luc taşıyan bir donmuş bir farenin beyin kesitli oldu . 10 mikron bölümü, hipoksik işaretleyici, pimonidazole ile boyanmış anti-lusiferaz boyama ile tespit lusiferaz ifade ile mekansal olarak ilişkili bulunmuştur hipoksi intratümöral heterojenite saptandı. Ölçeği bar, 100 mm.

Meme kanseri, beyin metastazı Evre IV meme kanseri hastalarının% 30'unda ortaya çıkar. Yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili ve medyan sağkalım 13 ay ⁶ sahiptir. , Intrakranial başlangıcında ve ilerlemesinde gibi patofizyolojik profilleri anlaşılmasını kolaylaştırmak için bu klinik yıkıcı hastalığı taklit etmek için uygun hayvan modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada, insan meme kanseri hücreleri, fare beyninin içine doğrudan enjekte edilerek ortotopik meme kanseri beyin metastazı modeli geliştirdik. Daha önceki deneyimler, radyolojik olarak görüntülenmiştir (MRG) intrakranial lezyon implantasyon yaklaşık 2 hafta sonra görünür olduğunu göstermiştir. Bu direkt enjeksiyonlu modeline alternatif olarak, son zamanlarda, kanser hücrelerini farelerde sol ventrikül içine enjekte edilerek başka bir ortotopik meme kanseri beyin metastazı modeli oluşturmak için bir intrakardiyak hücre enjeksiyonu yaklaşımı hayata geçirdik. Ancak, beyin metastazı eğilimli meme kanseri hücrelerinin ön seçim, bu ^model 7 multi-fokal beyin lezyonları ulaşmak için gerekli . Biz son zamanlarda aynı HRE-luc intrakardiyak enjeksiyon yoluyla fare beyin metastaz mümkün olan fare meme kanseri 4T1 hücreleri içine inşa girmiştik.

Biyoparlaklık görüntüleme floresan görüntüleme aksine, ışık uyarma ihtiyacı yoktur, son derece hassas ve verimli olur. Bu çalışmada, kemirgen modelleri derin yerleşimli tümörlerin görüntüleme, örneğin, fare intrakranial beyin tümörleri kolaylaştırır . Üç ya da beş fareler aynı zamanda görüntülü olabilir. Ancak, yakın kameraya gerekli olacaktır hayvan pozisyon ayarı, zayıf bir sinyal, tüm vücut imajı görüldü özellikle duyarlılığını artırmak. Bu durumda, her zaman sadece bir veya iki hayvanlar görüntülenebilir. BLI bir sınırlama anatomi düşük mekansal çözünürlükte tomografik görüntüleri oluşturmak için yöntemler olmasına rağmen. Mikro-CT veya MR görüntüleri ile birlikte kayıt anatomi doğru tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Kapsamlı çabaları in vivo tümör hipoksi ^8,9 izlemek için non-invaziv yaklaşımlar geliştirmeye çalıştılar edilmiştir. Hipoksi muhabiri gen, kanser hücrelerinin genom içine tanıtan, tümör hipoksi evrim uzunlamasına izleme optik ^{görüntüleme} 10,11 izlenebilir . Benzer şekilde, tümör hipoksi dinamikleri tedavisi sonrasında bu yaklaşımı kullanarak izlenebilir.

Lusiferaz ve substrata ek olarak, luciferase, oksijen ve ATP luciferin-lusiferaz tepki olarak ışığı üretmek için vazgeçilmez unsurlarıdır. Hipoksik ortamda, oksijen ve ATP üretimi mevcudiyeti, düşük ışık yayma yol açabilecek önemli ölçüde sınırlı olabilir. Ancak, in vitro BLI tahlil MDA-231/HRE-luc hücreleri normoksik durumuna kıyasla önemli ölçüde daha fazla ışık yaydığı hipoksik durum (<% 0.1 _O 2) altında inkübe olduğunu gösterdi . Ayrıca, tümör dokularının immünohistokimyasal verileri lusiferaz ifade ve pimonidazole arasında iyi bir mekansal korelasyon saptandı. Bu gözlemler, verimli ışık üretimi için gerekli olan oksijen konsantrasyonu ve ATP yaşayan memeli hücrelerinde bulunan düzeylerinin altında olduğunu öne sürerek, başkaları tarafından daha önceki çalışmaları ile iyi bir anlaşma. Ayrıca BOLD fonksiyonel MRI yaklaşımları, kombine (kan oksijen seviyesi bağımlı) ve (bağlı doku oksijen seviyesi), bu model değerlendirilir tümör hipoksi için MR ATAĞI var. Multimodal görüntüleme yaklaşımlar (yayınlanmamış veri) karşılaştırılabilir veriler elde edilmiştir. Ayrıca, hipoksik tümör hücrelerinin ve lusiferaz ifade hücrelerin immünohistokimyasal colocaliztion doğruladı. Tedaviye yanıt bazal tümör hipoksi ve dinamik değişiklikleri doğru bir şekilde değerlendirmesi rasyonel tedavi kombinasyonu ¹² izin gerekiyor.

Sonuç olarak, ucuz, hızlı ve son derece hassas BLI, non-invaziv in vivo tümör hipoksi dinamikleri değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir . Bu çalışmada spontan beyin tümörü modelinde kullanılmış olsa da, metodoloji kesinlikle kemirgenler, derin yerleşimli ortotopik tümörlerin diğer türleri için uygulanabilir.

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, DOD Meme Kanseri IDEA Ödülü kısmen desteklenen W81XWH-08-1-0583 ve NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) ve FAMRI klinik bilim adamı ödülü (DS). Görüntüleme altyapı U24 CA126608 ve Simmons Kanser Merkezi (P30 CA142543) ve NIH 1S10RR024757-01 tarafından kısmen desteklenen Uluslararası Küçük Hayvan Görüntüleme Araştırma Programı tarafından sağlanmaktadır.