Dans l'imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

L'imagerie par bioluminescence des inducible factor-1α activité hypoxie est appliqué pour surveiller le développement intracrânienne hypoxie tumorale dans un modèle de cancer du sein métastatique cerveau de souris.

Il est bien reconnu que l'hypoxie tumorale joue un rôle important dans la promotion de la progression maligne et affectant négativement la réponse thérapeutique. Il ya peu de connaissances sur in situ, in vivo, l'hypoxie tumorale pendant le développement intra-crânienne des tumeurs cérébrales malignes en raison du manque de moyens efficaces de le suivre dans ces tumeurs profondes orthotopique. L'imagerie par bioluminescence (BLI), basé sur la détection de la lumière émise par les cellules vivantes exprimant un gène de la luciférase, a été rapidement adopté pour recherche sur le cancer, en particulier, pour évaluer la croissance des tumeurs ou des changements de taille de la tumeur en réponse au traitement dans les études animales précliniques. Par ailleurs, en exprimant un gène rapporteur sous le contrôle d'une séquence promotrice, l'expression de gènes spécifiques peuvent être surveillés de façon non invasive par BLI. Sous le stress hypoxique, les réponses de signalisation sont médiés principalement par les inductible factor-1α hypoxie (HIF-1α) pour conduire la transcription des gènes différents. Par conséquent, nous avons utilisé une construction de HIF-1α journaliste, 5HRE-ODD-Luc, transfectées de façon stable dans le cancer du sein humain MDA-MB231 cellules (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Dosage in vitro de HIF-1α bioluminescence est effectuée par incuber les cellules transfectées dans une chambre hypoxique (0,1% O ₂₎ pendant 24 heures avant le BLI, tandis que les cellules en normoxie (21% O ₂₎ servir de contrôle. Significativement plus élevé de flux de photons observés pour les cellules en hypoxie suggère une augmentation de HIF-1α se liant à son promoteur (éléments HRE), comparativement à ceux qui en normoxie. Les cellules sont injectées directement dans le cerveau de la souris pour établir un cancer du sein, métastases cérébrales modèle. Dans l'imagerie par bioluminescence in vivo de la dynamique de l'hypoxie tumorale est initié deux semaines après l'implantation et répétée une fois par semaine. BLI révèle l'augmentation des signaux lumineux du cerveau comme la progression tumorale, indiquant augmenté hypoxie tumorale intracrânienne. Des études histologiques et immunohistochimiques sont utilisés pour confirmer les résultats de l'imagerie in vivo. Ici, nous allons introduire des approches d'analyse in vitro de HIF-1α bioluminescence, l'établissement chirurgicale d'une métastase cérébrale du cancer du sein chez une souris nude et l'application de l'imagerie par bioluminescence in vivo pour contrôler l'hypoxie tumorale intracrânienne.

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel Utilisation de l'Université du Texas Southwestern Medical Centre.

1. Dosage in vitro de HIF-1α bioluminescence

1. Matériel et méthodes:
   • Homme de ligne métastatique des cellules de cancer du sein MDA-MB231 transfectées avec un gène rapporteur HIF-1-dépendante roman, 5HRE-ODD-Luc a été générée par le Dr Harada.
   • En condition d'hypoxie, l'expression accrue de la dégradation de domaine dépendant de l'oxygène (ODD)-luciférase protéine de fusion est entraîné par 5 exemplaires de l'hypoxie-réponse de l'élément (5HRE). La présence d'ODD provoque la dégradation de ODD-Luc protéines résultant de très faible activité de fond luciférase dans des conditions de normoxie. Par conséquent, ce nouveau système peut être utilisé pour détecter les régions hypoxiques dans une tumeur par imagerie en temps réel. La construction de ce vecteur d'expression 5HRE-ODD-Luc a été rapporté par Harada et al ^1,2.
2. Cellules Culture sous normoxie ou d'hypoxie:
   • Maintenir le recombinant cellules MDA-MB231 de 10% de sérum de veau fœtal (SVF)-milieu DMEM contenant 1% de glutamine, des antibiotiques de 400 pg / ml de G418 et 1% de pénicilline / streptomycine.
   • Pour le dosage in vitro de HIF-1α bioluminescence, la plaque 3 x 10 ⁵ cellules MDA-MB231 exprimant 5HRE-ODD-Luc vecteur dans chaque puits de deux six plat bien.
   • Laisser les cellules à attacher au mur plat après une nuit d'incubation et ensuite transférer un plat dans une chambre d'hypoxie (Billups-Rothenberg, Inc Del Mar, CA) pour les études de l'hypoxie, tandis que l'autre plat maintenir en condition normoxique (21% O _2).
   • Remontez la chambre et la chambre à gaz avec 0,1% d'O ₂ en connectant le tube orifice d'entrée avec une bouteille de gaz.
     Remarque: Les deux brides d'entrée et de sortie du port doit être ouvert pendant cette procédure.
   • Déconnecter la source de gaz après la chambre a été purgé et chambre d'étanchéité par la fermeture de pinces en plastique.
   • Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
     Note: La chambre doit être humidifié pour éviter l'évaporation excessive des cultures. Ceci peut être accompli en plaçant 10 - 20 ml d'eau stérile dans la chambre.
3. Dosage de bioluminescence:
   • Après 24 heures d'incubation, éliminer le milieu et laver les cellules rapidement avec PBS glacé (2X).
   • Ajouter 1 ml de PBS froid avec 100 pi de luciférine (Biotechnologie Or, St Louis, MO).
   • Acquérir BL imagerie (système Spectrum IVIS, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) avec des durées d'exposition différentes (1, 30, 60, 180 s).
   • Mesurer l'intensité lumineuse dans chaque puits en utilisant le logiciel image vivante (Caliper Life Sciences).

2. Création d'un modèle de cancer du sein métastase cérébrale

1. Préparation des cellules MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
   • Récupérer et la culture des cellules dans un milieu de DEME MDA-MB231/5HRE-ODD-luc contenant 10% de FBS, 1 glutamine% et 1% de pénicilline / streptomycine.
   • Remplacer moyenne tous les 2-3 jours. Tripsinize et laver les cellules quand elles atteignent 80% de confluence.
   • Compter le nombre approprié de cellules et de les remettre en suspension dans un milieu de DEME sans sérum de Matrigel 25% (BD Biosciences, San Jose, CA) avec une concentration finale de 10 ⁵ cellules dans le volume 4 pl.
   • Cellules de lieu sur la glace avant l'injection intracrânienne.
2. L'implantation chirurgicale
   • Souris nude femelles (BALB / c nu / nu; National Cancer Institute, Bethesda, MD) à 4-6 semaines d'âge sont utilisés dans cette étude.
   • Anesthetize (3% d'isoflurane / O2 dans une chambre d'induction; isoflurane de Baxter International Inc, Deerfield, IL, Etats-Unis) et de maintenir les animaux avec de l'isoflurane (1%) dans de l'oxygène (1 dm ³ / min) pendant l'intervention chirurgicale ^3.
   • La peau doit être pariétal droit préparé avec la bétadine et ensuite 70% d'alcool avant l'incision.
   • En utilisant une perceuse à haute vitesse, sans bavures un trou de 1 mm dans l'hémisphère droit du crâne, 1mm antérieur à la suture coronale et 2 mm latéralement à la suture sagittale.
   • Draw 4 mélange de cellules ul (10 ⁵ cellules) en utilisant une seringue Hamilton de 10 ul (Hamilton Company, Reno, NV). Injecter des cellules directement dans le droit caudale diencéphale, 1,5 mm sous la dure-mère avec un sur-mesure 32G Hamilton aiguille. Gardez l'aiguille en place pendant environ 30 s avant le retrait. Utilisation d'une aiguille 32G fines minimise les dommages tissulaires.
   • Remplissez le trou de trépan avec de la cire d'os et de fermer le cuir chevelu avec des sutures résorbables.
   • Préparer la région incision avec 70% d'alcool.
   • Appliquer la buprénorphine analgésie toutes les 12 heures pendant deux jours.

3. Dans l'imagerie par bioluminescence in vivo de tumeurs dynamiques hypoxie dans les métastases cérébrales du cancer du sein

• Initier l'imagerie par bioluminescence longitudinale (système Spectrum IVIS) deux semaines après l'implantation intracrânienne et de répéter une fois par semaine pendant 8-10 Semaines.
• Anesthetize trois souris à un moment (3% d'isoflurane / O ₂ dans une chambre d'induction)
• Administrer une solution de D-luciférine (120 mg / kg dans du PBS dans un volume total de 80 ul; Biotechnologie or) sous-cutanée dans la région du cou de chaque souris comme décrit en détail précédemment ^4.

D-luciférine est non-toxique et a été montré pour être capable de pénétrer intacte barrière hémato-encéphalique (BHE) et des membranes cellulaires ^3,5.

• Placez la souris 3 dans la chambre de l'imagerie et maintenue avec l'isoflurane (1%) dans de l'oxygène (1 dm ³ / min) pendant l'imagerie.
• Cinq minutes après l'injection luciférine, acquérir BL imagerie avec un tableau de temps d'exposition différents (1, 30, 60, 180 s).

Nos observations montrent que la durée d'émission de lumière est maximale à environ 5 minutes après l'administration sous-cutanée de luciférine dans la région de ^3,4 cou.

• Analyser les données avec le logiciel d'imagerie habitable (Caliper Life Sciences) en utilisant le nombre absolu de photons (photons / s) dans une région d'intérêt (ROI), tracées manuellement de décrire le signal BLI du cerveau.
• Bien sûr la courbe Tracer le temps des comptages de photons pour indiquer la dynamique hypoxie tumorale.
• Immédiatement après la dernière BLI, administrer pimonidazole, le marqueur de l'hypoxie et une heure plus tard, le sacrifice de la souris et de disséquer le cerveau. Intégrer le cerveau entier dans la température de coupe optimale (PTOM) à moyen et gel -80 ° C au congélateur. Après coloration histologique violet de crésyl et la coloration immunohistochimique contre la luciférase, un marqueur d'hypoxie pimonidazole, et HIF-1α effectués pour valider les observations d'imagerie.

4. Les résultats représentatifs:

Comme le montre la figure 1, sensiblement plus élevé de signal BLI a été observée après incubation des cellules transfectées dans la chambre hypoxique (1% O ₂₎ pendant 24 heures. Émission de lumière faible a été observée à partir des cellules de contrôle en vertu normoxie. Cela peut résulter de la population de cellules surpeuplées après 24 h de culture de 3 x 10 ⁵ cellules, ce qui induit un signal de stress pour les cellules pour surexprimer HIF-1α. Néanmoins, dans les résultats in vivo BLI ont été validés par la coloration immunohistochimique montrant une colocalisation entre hypoxie tumorale et expression de la luciférase.

Un tableau automatisé des temps d'exposition permet d'acquisitions continue d'une série d'images, ce qui facilite la capture d'un signal faible avec le temps d'exposition plus long, et des signaux forts en utilisant un temps plus court, sans saturer le CCD.

Figure 1 test in vitro avec HIF-1α bioluminescence Rangée du haut:. 3 x 10 ⁵ cellules MDA-MB231/5HRE-ODD-luc incubées dans chaque puit d'une 6-bien-plat dans une chambre d'hypoxie (0,1% O ₂₎ pour 24 heure avant le milieu a été enlevé, lavé et remplacé par 1 ml de PBS. Immédiatement après 100 luciférine ul a été ajouté dans chaque puits, BLI a été acquise avec un tableau de durées d'exposition (1, 30, 60, 180 s). Forte luminescence a été observée à partir de puits représentatifs Rangée du bas:. Comme contrôle, 3 x 10 ⁵ cellules incubées sous normoxie (21% O ₂₎ émis faible lumière.

Figure 2 Dans l'imagerie par bioluminescence in vivo de la dynamique de l'hypoxie tumorale. A) Un signal faible lumière du côté droit du cerveau de souris a été visualisée 5 semaines après l'implantation intracrânienne d'MDA-MB231/5HRE-ODD-luc cellules cancéreuses du sein. Augmentation du signal optique a été observée au cours supplémentaire de 6 semaines, indiquant l'hypoxie tumorale accrue. B) L'intrigue a montré la courbe bien sûr le temps d'quantitative compte de photons de signal lumineux.

Figure 3 Colocaliztion de la luciférase et l'hypoxie détecté par immunohistochimie-chimiques de coloration. Un cerveau de souris congelées portant une métastase d'un cancer du sein MDA-MB231/5HRE-ODD-luc embarqué dans de l'OCT a été sectionnée. A l'article 10 um immunocolorés avec marqueur d'hypoxie, pimonidazole, a révélé une hétérogénéité intratumorale de l'hypoxie, qui a été trouvé pour corréler spatialement avec expression de la luciférase détectés par les anti-luciférase coloration. La barre d'échelle, 100 um.

Métastases cérébrales du cancer du sein survient dans 30% des patients atteints de cancer du sein au stade IV. Elle est associée à une morbidité et une mortalité élevées et a une survie médiane de 13 mois ^6. Il est nécessaire d'avoir des modèles animaux appropriés pour imiter cette maladie dévastatrice sur le plan clinique, afin de faciliter notre compréhension de son initiation et la progression intracrânienne ainsi que des profils physiopathologiques. Ici, nous avons développé un cancer du sein métastase cérébrale orthotopique du modèle en injectant des cellules humaines de cancer du sein, directement dans le cerveau de souris. Nos expériences antérieures ont montré qu'une radiographie visualisée (par IRM) lésion intracrânienne apparaît environ 2 semaines après l'implantation. Alternative à ce modèle à injection directe, nous avons récemment mis en œuvre une approche cellulaire intracardiaque injection pour créer un autre cancer du sein métastase cérébrale orthotopique du modèle en injectant des cellules cancéreuses dans le ventricule gauche de la souris. Cependant, la pré-sélection de métastases cérébrales sujettes cellules du cancer du sein est nécessaire pour atteindre des lésions cérébrales multifocales dans ce modèle ^7. Nous avons récemment introduit de la même HRE-Luc construction dans les cellules de souris 4T1 le cancer du sein qui sont capables de métastaser dans le cerveau de la souris par injection intracardiaque.

L'imagerie par bioluminescence est très sensible et efficace, qui, contrairement à l'imagerie de fluorescence, n'a pas besoin de lumière d'excitation. Cela facilite l'imagerie des tumeurs profondes dans des modèles rongeurs, par exemple, les tumeurs cérébrales intracrâniennes de la souris dans cette étude. Trois ou même cinq souris peut être imagée au même moment. Toutefois, pour augmenter la sensibilité en particulier lorsque le signal est faible a été vu sur l'image du corps entier, réglage de la position des animaux proches de la caméra sera nécessaire. Dans ce cas, seuls un ou deux animaux peuvent être visualisés à chaque fois. Une limitation de BLI est faible résolution spatiale de l'anatomie bien qu'il existe des méthodes pour générer des images tomographiques. Co-inscription avec des micro-CT ou IRM aiderait à identifier correctement l'anatomie.

Des efforts considérables ont été cherché à développer des approches non invasives pour surveiller l'hypoxie tumorale in vivo ^8,9. En introduisant un gène rapporteur hypoxie dans le génome des cellules cancéreuses, un suivi longitudinal de l'évolution hypoxie tumorale peut être contrôlé par imagerie optique ^10,11. De même, la tumeur après traitement dynamique de l'hypoxie peut être contrôlé en utilisant cette approche.

En plus de la luciférase et de son substrat, la luciférine, de l'oxygène et l'ATP sont des éléments indispensables dans la réaction luciférine-luciférase pour produire la lumière. Dans un environnement hypoxique, la disponibilité de l'oxygène et la production d'ATP peut être considérablement limitée, ce qui pourrait entraîner une émission de lumière réduite. Cependant, notre analyse in vitro, BLI a démontré que les cellules MDA-231/HRE-luc incubées sous la condition d'hypoxie (<0,1% O ₂₎ émis beaucoup plus de lumière, par rapport à ceux en état ​​normoxique. Par ailleurs, les données immunohistochimiques de tissus tumoraux a révélé une bonne corrélation spatiale entre l'expression de la luciférase et pimonidazole. Ces observations sont en bon accord avec les études antérieures effectuées par d'autres, ce qui suggère que la concentration en oxygène et de l'ATP nécessaire à la production efficace de la lumière sont bien en dessous de leurs niveaux de vie dans les cellules de mammifères. Nous avons également combiné des approches fonctionnelles IRM, GRAS (niveau d'oxygène du sang à charge) et a dit (le niveau d'oxygène des tissus dépendant) d'IRM à l'hypoxie tumorale évaluée dans ce modèle. Des données comparables ont été obtenus à partir des approches d'imagerie multimodale (données non publiées). Par ailleurs, la coloration immunohistochimique ont confirmé colocaliztion des cellules tumorales hypoxiques et des cellules exprimant la luciférase. Une évaluation précise de l'hypoxie tumorale de base et les changements dynamiques dans la réponse au traitement devrait permettre rationnelle ¹² combinaison thérapeutique.

En conclusion, le bon marché, rapide et BLI très sensible peut être un outil utile pour évaluer de façon non invasive des tumeurs in vivo la dynamique de l'hypoxie. Alors que le modèle orthotopique du cerveau tumeur a été utilisée dans cette étude, la méthodologie peut certainement être appliquée pour d'autres types de tumeurs profondes orthotopique chez les rongeurs.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Cette étude est financée en partie par le DOD sein prix IDEA cancer W81XWH-08-1-0583 et le NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) et d'attribution FAMRI scientifique clinique (DS). L'infrastructure d'imagerie est fournie par des animaux sud-ouest de petit programme de recherche d'imagerie soutenu en partie par U24 CA126608 et Simmons Cancer Center (P30 CA142543) et NIH 1S10RR024757-01.