3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

Bu makalede, biz gerçekleştirmek için kolay ve görüntü yetişkin fare beyin damar ağacı kullanılabilir serebrovasküler döküm için basit ve pratik bir tekniği mevcut.

Vasküler görüntüleme, serebrovasküler hastalıklar, beyin arteriovenöz malformasyonlar (BAVMs) klinik tanı ve tedavisinde çok önemlidir. Hayvan modelleri, serebrovasküler hastalıklar etiyopatogenezinin multi ve potansiyel tedaviler eğitimi için gerekli olan. Görüntüleme büyük hayvanlarda damar nispeten kolaydır. Ancak, damar görüntüleme yöntemleri fare beyin hastalığı modelleri gelişmekte olan genetiği değiştirilmiş fare hatlarının maliyeti ve yer durumu nedeniyle arzu edilen bir durumdur. Görüntüleme fare serebral vasküler ağacın bir sorundur. Insanlar ve büyük hayvanlar, makrovasküler angioarchitecture değerlendirilmesi için altın standart (iletkenlik) x-ray kontrast tabanlı kateter anjiyografi, küçük kemirgenler için uygun bir yöntem değil.

Bu makalede, birçok d kullanarak, analiz edilebilir arterler, venler ve kılcal damarlar dahil olmak üzere, tüm vasküler yatağın dayanıklı bir iskelet oluşturur, serebrovasküler döküm bir yöntem mevcutifferent yöntemleri. Fare cerebrovasculature mikrodamarlar komple döküm zor olabilir, ancak bu zorlukları, adım-adım, bu protokolde ele alınmaktadır. Vasküler döküm malzeme Intracardial perfüzyon sayesinde, vücuttaki tüm damarları döküm. Beyin sonra kaldırılır ve organik solvent metil salisilat kullanılarak açıklık olabilir. Beyin kan damarlarının üç boyutlu görüntüleme, herhangi bir konvansiyonel aydınlık mikroskop ya da diseksiyon mikroskobu ile basit ve masrafsız bir görüntülenebilmekte. Döküm cerebrovasculature aynı zamanda görüntülü ve mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) ¹ kullanılarak sayısal olabilir. Buna ek olarak, görüntülü edildikten sonra, döküm beynin histolojik analiz için parafine gömülü olabilir.

Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bu damar döküm yöntemi yararı aydınlık mikroskopik analizi de dahil olmak üzere, çeşitli analitik araçlar, geniş bir adaptasyon, CT nedeniyle radyoopak karakteristik taramamalzemenin yanı sıra, histolojik ve immünohistokimyasal analiz teristic. Bu doku etkin kullanımı, hayvan kullanımını kaydetmek ve maliyetleri azaltabilir. Biz son zamanlarda düzensiz kan damarlarını mikroskobik ^seviye 2 yetişkin BAVM bir fare modeli görselleştirmek, ve mikro-CT taraması görüntülü biçimlendirilmiş damarların ilave bir resim sağlamak için bu yöntemi uygulaması göstermiştir . Bu yöntemin dezavantajı var ve her türlü analiz için ideal olmamasına rağmen, kolay öğrenilen ve vücutta yaygın kan damarlarının damar döküm uygulanan bir basit, pratik bir tekniktir.

1. Kan damarları gelen Takas

1. Fare 0.25 ml serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg xylazine ile 100 mg / kg ketamin intraperitoneal anestezisi.
2. Anestezi pençe tutam hiçbir yanıt tarafından onaylandıktan sonra, diyafram üzerinden kesilmiş, sadece xiphoid işlemi aşağıda makas, göğsünde bir kesi yapmak için makas kullanmak ve dorsal ve ventral segment, göğüs boşluğu maruz ile göğüs kafesi arasında kesmek. Sternum ve komşu göğüs duvarı, katlama ve hemostat ile güvenli kalp Açığa. Perikard kesesi, kalp açığa çıkarmak için cımbız ile açın.
3. PBS artı heparin (5 adet / ml) sıcak su banyosu çözüm 37 ° C ve çıkışı künt 22 gauge iğne ile tüp sıcak bağlı perfüzyon pompası (basınç 100mmHg) açın
4. Kalbin apekse yakın, sol ventrikül içine iğne takın. Sistemik kan çıkışı hemen etkinleştirmek için sağ atrium ve açık kesmek kadar kan i yıkamaya devam edindolaşımdan kaldırılmış.

2. Damar Sistemi içine Döküm Agent Perfüzyon

1. Mix süzülmüş MV bileşik 4 ml ile 5 ml OG seyreltici: Microfil (Akış Tech, Inc Carver, MA) üreticinin protokol başına döküm çözüm hazırlayın. Katalizör 450μl (% 5) (OG sertleştirici) ekleyin. Çözüm çalışma süresi 20 dakikadır, ancak uygun viskozite sağlamak için kullanmadan önce hemen karıştırın.
2. 10ml şırınga içine ajan çözüm döküm Çekme 20 künt bir iğne, şırınga takın ve çözümü ile iğne doldurun.
3. Sol ventrikül içine kan kızarma için kullanılan aynı delikten iğne takın. Güvenli iğne kalp hemostat kelepçe yerleştirin.
4. Döküm ajan çözümü yaklaşık 3 ml / dk yavaş yavaş sol ventrikül içine enjekte edilir. Aşırı basınç döküm ajan veya potansiyel damar rüptürü yanlış akışına neden olabilir.
5. Dahil olmak üzere başarılı bir perfüzyon belirtilerini arayın: döküm görselleştirilmesibağırsak ve karaciğer damarsal, distal ekstremite renk değişikliği, ve burun ve dilde renk değişikliği ing ajan. Gerekli uygun perfüzyon ulaşmak için iğne yeniden ayarlayın.

3. Doku Toplama ve İşleme

1. % 4 paraformaldehid beyin ve yer çıkarın gece 4 ° C
2. % 25 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 1 gün,% 75 EtOH, 1 gün,% 95 EtOH, 2 gün ve% 100 EtOH, 2 gün oda sıcaklığında giderek konsantre EtOH içine doğrudan paraformaldehid koyarak beyin dehydrate: .
3. 2 gün boyunca oda sıcaklığında metil salisilat perfüze beyin çeker, kan damarlarının çevresindeki beyin dokusu netleştirin.
4. Bütün unsectioned açıklık beyin damarları, beyin, diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) veya aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) (Leica DM / altında metil salisilat içine ile görüntülenmiş olabilir LS, Leica Microsystems).
5. Reclarificationdoku tamamen temizlenir değilse yapılabilir. Metil salisilat, transfer beyin itibaren 2 gün boyunca% 95 EtOH, 2 gün boyunca% 100 EtOH ve 2 gün boyunca metil salisilat.

4. Micro-CT Görüntüleme veya histolojik Uygulama Doku Hazırlama

1. Beyin doğrudan (Şekil 4) açıklama sonra veya yeniden hidrasyon sonra mikro-BT ile görüntülenebilir.
2. Beyin dokusu histolojik analiz için hazırlamak için, seri seyreltilmiş EtOH ile beyin rehidrate% 95 EtOH, 1 gün;% 75 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 2 gün,% 25 EtOH, 2 gün% 100 EtOH, 1 gün: PBS içinde saklayın. Beyin, daha sonra standart bir prosedür kullanılarak parafine gömülü olabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Vasküler döküm cerebrovasculature makroskobik beyin yüzeyi (Fig.1A) görülebilir. Parankim içinde damar ağacı (Şekil 1B) görüntülenmiştir aşağıdaki açıklama olabilir. Detaylı bir damar yapısıgörüntülü ve kapsamı diseksiyon (Şekil 3) ve mikro-BT (Şekil 4), bir aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) altında analiz edilebilir. Aydınlık alan mikroskobu kullanarak, damar, yüksek büyütme (Şekil 2B) (Şekil 2A) beynin yanı sıra bireysel mikrodamarlar kesit farklı odak uçakları görülebilir. Diseksiyon kapsamında, bir cerebrovasculature üç boyutlu yapısı (Şekil 3) daha iyi görselleştirme izin, tek bir odak düzlemli tüm vasküler yapı görebilirsiniz. Büyük damar morfolojisi ve tüm beynin damarsal bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen görüntüler gösterir, ancak aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2B) ile çekilen fotoğrafları gösterilen detayları eksikliği olabilir. Bu teknik bize deneysel BAVM yetişkin fare modelinde ² düzensiz damarları tespit etmek için izin verdi. Şekil 5 mikro-BT (Şekil 5A) ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 5B) tarafından tespit edilen aynı düzensiz damarlarının bir örnek gösterir. Hep birlikte, bu veriler t analiz olduğunu gösterirvasküler attıktan sonra çoklu görüntüleme araçları ile aynı örnek.

Şekil 1. Tüm fare beyin damar döküm. Önce (A) ve (B) solvent metil salisilat açıklama sonra. Gemileri beyin yüzeyinin (A) ve parankim aşağıdaki açıklama prosedürü (B) açıkça görüntülenmiştir.

Şekil 2 açıklık vasküler döküm beyin aydınlık mikroskop görüntüleri. Beyin, çeşitli uçaklar ve farklı büyütme seviyelerinde görüntülü olabilir. Ölçek Bar 200μm (A) ve (B) 50μm.

Şekil 3 dorsal görünümü gösteren tüm yetişkin fare beyin cerebrovasculature 1x mikroskopta görüntü Diseksiyon.

Şekil 4 Micro-CT dorsal görünümü Şekil 3'te gösterilen tüm yetişkin fare beyin tarama görüntü.

Şekil 5 beyin arteriovenöz malformasyon tespit etmek için vasküler döküm yöntemi uygulanması. A) beyin damar döküm Micro-CT taraması ventral bir görünümden sağ hemisfer genişletilmiş, düzensiz AVM gibi gemiler bölge gösterir. Bölge büyütülmüş görüntü (beyaz kutu), sağ tarafta gösterilmiştir. B) Aynı düzensiz damarlar 50x büyütme aydınlık mikroskop altında görüntülendi. Ölçek çubuğu 50 mm.

Biz burada çeşitli yöntemleri ile görüntülü olabilir yetişkin fare cerebrovasculature döküm için bir yöntem raporu. Bu yöntemin hastalık modeli BAVM Uygulama düzensiz damarlarının 3 boyutlu analiz sağlar. Potansiyel gelecek çalışmalar, mikro-BT görüntüleri nicelik, histolojik analiz, doku ve damar hastalığı ilerlemesi tanısı içerir.

Ortak Sorunlar ve Öneriler Karşılaşılan

Beynin damarsal Komple perfüzyon her zaman elde değil. Sol atrium veya aort çatlaması olmaksızın distal kan damarları ulaşmak için yeterli basınç olması bir sorundur. Bunu aşmak için, yaklaşık 100mmHg tutarlı bir basınç uygulayın. Ayrıca, aort içine ajan döküm uygun çıkış sağlamak için iğne pozisyonu ayarlayın. Döküm ajan beyin damarlarının ulaşabilirsiniz karotis arterler sınırlı değildir ki önemlidir. Kritik işlemler için geliştirilmiş küçük bir gemi ile ilişkilifüzyon (1): damar kan uygun takas döküm ajan (2) filtrasyon; ve (3) ajan enjeksiyon döküm sırasında iğne yerleştirilmesi. Bakım, sol atrium ve akciğer içine ajan döküm enjeksiyon önlemek için alınmalıdır. Diğer araştırmacılar başarıyla ek prosedürleri kullanarak ³ olmadan fare ve sıçan ⁴ cerebrovasculature perfüze var. Hemotoxylin% 93 damar lümeni perfüzyon ⁵ gösterdi Microfil perfüze gemilerin Manuel analiz zıt. Daima atmayın veya hızlı polimerize ve araçlar çok konular için kullanılamaz olarak döküm maddesi ile temas gelen herhangi bir araç tamamen temiz. Çevresindeki fare beyin dokusu netleştirilmesi zor olabilir. Metil salisilat batırıldıktan sonra, doku, damar görüntüleme zorlaştırır opak görünebilir. Uygun dehidratasyon ve açıklama sağlanması, bu sorunu çözmek gerekir. Bir rocker beyin dokusunun yerleştirilmesi sırasında alkol ve metil salicylate tedavi doku açıklama artırabilir.

Tekniğin dezavantajları

Bu tekniğin sınırlamalar şunlardır: (1) katalizör ilave edildikten sonra hızlı bir şekilde kalınlaşmasına olarak karıştırılarak hemen sonra döküm ajan çözüm enjekte etmek için gerekli olan, (2) döküm aracı kolayca büyük iletkenlik damarları doldurur, ama değil mi arteriol (direnç damarları) ve kılcal (besleyici damarlar) gibi güvenilir küçük gemilere, dolgu ve bazı gruplar mikro-CT görüntüleme ^1,6 Microfil tercih rağmen (3), mikro-BT görüntüleme için en iyi radyoopak kontrast değildir. Ancak, uygun iğne yerleştirilmesi, geminin konumu ve perfüzyon basıncı da dahil olmak üzere yukarıda önerilen önerileri aşağıdaki, küçük damarları tam bir döküm elde edilebilir. Çeşitli analiz araçları çeşitli adaptasyon, bu ajan, arteriyel ve venöz dolaşım da dahil olmak üzere, serebrovasküler yapısını analiz etmek için değerli bir araç yaparperspektifler.

Tekniğin Uygulamaları

Bu yöntemin avantajı, geniş bir uygulama potansiyeli. Döküm, arterler, venler, bünyesinde tüm doku kılcal damarları dahil tüm damarları, dolgular, çeşitli türler birden fazla organların vasküler yapıları analiz edilebilir. Daha önceleri, diğer grup insan, maymun ^{9, 10} koyun, sıçan ^4,11,12, fare ^{3,13 8 7} büyük ve küçük gemiler için bu perfüzyon kullanmışlardır. Biz şimdi, hem de sağlıklı ve hastalıklı devletlerin, fare beyin mikrodamarlar yapısını ^analiz 2 bu tekniği kullanarak kanıt gösteriyor . Buna ek olarak, çeşitli organlarda gemilerin görselleştirme artırmak için farklı boyutlarda ve farklı renkler gemileri serpmek için çeşitli viskozite Microfil çözümleri vardır. Örneğin, kırmızı ile tezat soluk beyin parankimi kolayca görüntülenebilmekte ve sarı olabilirkoyu kırmızı miyokardın. Ayrıca, malzeme radyoopak olduğu gibi, damarlar mikro-CT 3D dönebilen bir görüntü elde etmek için tarama görüntülü olabilir. Dokusu aynı zamanda görüntülü edildikten sonra parafin bölümleri ve histolojik analiz için kullanılabilir.

Sonuç

Damar, cerebrovasculature morfolojik yapısını incelemek için bir dizi analiz teknikleri kullanarak adapte edilebilir yetişkin fare beyin, kan damarları, bir döküm yapmak için buraya bir protokol göstermektedir. Ayrıca, düzensiz şekilli genişlemiş damarlar tarafından temsil edilen, BAVM hastalık durumu bir model, bu yöntemin uygulanması için kanıt sağladı venöz dolaşım için arteriyel kan şant. Çeşitli vasküler döküm yöntemleri vardır. Bir damar döküm için buraya sağlayan basit bir protokoldür, çeşitli görüntüleme yöntemleri kullanılarak yetişkin fare beynin damarsal incelemek için bir araç olarak kullanılıyor olabilir.

Laboratuar hayvanlarının kullanıldığı için deneysel prosedürler, University of California, San Francisco (UCSF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

Yazarlar Voltaire Gungab yazının hazırlanmasında yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe tarafından desteklenen: H. Su Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 GM008440 EJ Walker, WL Genç ve H. Su R01 NS27713 WL Genç, P01 NS44155) ve R21 NS070153; ve Amerikan Kalp Derneği (AHA 10GRNT3130004 H. Su).