成年鼠脑铸造三维成像和形态分析

在这篇文章中，我们提出一个简单的实用技术，为脑血管铸造，很容易执行，并可以利用图像的成年鼠脑血管树。

血管造影是脑血管疾病，如脑动静脉畸形（BAVMs），在临床诊断和管理的关键。动物模型研究etiopathology和潜在的治疗脑血管疾病的的必要。成像的大型动物的血管是比较容易的。然而，发展船舶小鼠脑疾病模型成像方法是可取的，由于转基因小鼠线路的成本和可用性。成像小鼠脑血管树是一个挑战。在人类和较大的动物，评估在大血管angioarchitecture的黄金标准（电导）级X射线导管造影对比，不适合小老鼠的方法。

在这篇文章中，我们提出了一个脑铸造的方法，产生了整个血管床的耐用的骨架，包括动脉，静脉和毛细血管，可分析使用许多Different方式。鼠标cerebrovasculature微血管全面铸造可困难;然而，在这一步一步协议解决这些挑战。通过intracardial灌注血管铸型材料，身体的所有船只都铸造。大脑可以被删除，使用有机溶剂的水杨酸甲酯澄清。三脑血管三维成像，可以可视化，简单，成本低廉与任何传统的明场显微镜或解剖显微镜。铸造cerebrovasculature也可以使用微型计算机断层扫描（显微^CT）1成像和量化。此外，铸造脑成像后，可以嵌入在石蜡病理分析。

与其他技术相比，这种血管铸型方法的好处是其广泛的适应各种分析工具，包括明的微观分析，CT扫描由于透X线的字符的材料，以及组织学和免疫组化分析teristic。这种组织的有效利用，可以节省动物的使用和降低成本。最近，我们已经证明这种方法的可视化在微观^层面 2在成年BAVM的小鼠模型的不规则血管，微CT扫描成像畸形血管提供额外的图像应用程序。虽然这种方法也有缺点，可能并不适合于所有类型的分析，它是一种简单，实用的技术，可以很容易地教训和广泛应用于全身各处血管的血管铸型。

1。清除血液从血管

1. 100毫克/千克10毫克/千克0.25 ml生理盐水稀释甲苯噻嗪对氯胺酮腹腔注射麻醉小鼠。
2. 一旦证实一爪子掐无反应，麻醉已通过膜片切割剪刀，略低于xyphoid过程，使整个胸部切口，剪刀切背，腹段的肋骨暴露胸腔之间。折叠起来胸骨和邻近胸壁和安全与止血暴露心脏。用镊子打开心包囊，暴露心脏。
3. 打开连接到温暖PBS加肝素（5单位/毫升）热水澡的解决方案，在37 ° C和22钝的针头流出管。灌注泵（100mmHg压力）
4. 针插入左心室，靠近心脏的顶点。立即切开右心房，使全身的血液流出，并继续冲洗，直到血我从流通中删除的小号。

2。铸造代理灌注到血管系统

1. 准备Microfil（流技术，公司卡佛，马）铸造每制造商的协议解决方案：混合与4毫升过滤的MV化合物的MV稀释液5毫升。加入450μl的催化剂（5％）（MV固化剂）。解决方案的工作时间是20分钟，但混合使用前，以确保适当的粘度。
2. 撤柜铸造成10ml注射器剂溶液，将一种生硬的20号针头注射器和填充的解决方案针。
3. 通过使用相同的孔冲洗血液进入左心室插入针。安全进针，止血钳对心脏的地方。
4. 慢慢进入左心室注入铸造剂溶液约3毫升/分钟。压力过大，可能会导致不正确的流量铸造代理人或潜在的血管破裂。
5. 寻找成功灌注的迹象，包括：可视化铸造在小肠和肝脏血管，远端肢体变色，鼻子和舌头变色剂。调整针，如果要达到适当的灌注。

3。收集和组织处理

1. 大脑和4％多聚甲醛，放置过夜取出4 ° C。
2. 从多聚甲醛直接放置到越来越多地集中在室温乙醇脱水大脑：25％乙醇，1天，50％乙醇，1天，75％的乙醇，1天，95％乙醇，2天;和100％乙醇，2天。
3. 澄清沉浸在水杨酸甲酯在室温下2天灌注脑血管周围脑组织。
4. 整个unsectioned澄清脑血管可与水杨酸甲酯沉浸在在解剖显微镜（图1）（徕卡MZFL第三显微镜，徕卡显微系统，班诺克本，白细胞介素）或明场显微镜（图2）（徕卡马克/下的脑成像LS，莱卡微系统）。
5. Reclarification可以做，如果组织没有完全清除。从水杨酸甲酯，脑转移，95％的乙醇2天，2天100％的乙醇，水杨酸甲酯2天。

4。显微CT成像或组织学的应用，组织准备

1. 大脑可以使用后直接澄清或再水化后（图4）显微CT成像。
2. 为了准备脑组织作病理分析，补充水分通过串行稀释乙醇的大脑：100％乙醇，1天，95％乙醇，1天，75％乙醇，1天，50％乙醇，2天; 25％乙醇，2天;并存储在PBS。大脑可以被嵌入在使用一个标准程序石蜡。

5。代表性的成果

血管铸型后，可以看到cerebrovasculature，从宏观上脑表面（图1a）。实质内的血管树可以可视化的以下澄清（图1B）。详细的血管结构可成像和分析下一个明场显微镜（图2），解剖的范围（图3），并与微CT扫描（图4）。使用明场显微镜，血管可以被视为不同的焦平面，没有在更高的放大倍率（图2B）切片的大脑（图2A）以及个人微血管。解剖的范围下，人们可以看到一个焦平面整个血管结构，从而实现了更好的三个cerebrovasculature的三维结构（图3）可视化。在解剖显微镜下拍摄的图像可以显示大血管的形态和全脑血管，但缺乏与明场显微镜（图2B）拍摄的照片显示的细节。这项技术使我们能够检测不规则的船只，在我们的实验BAVM成年小鼠^模型 2 。图5显示了一个微型CT扫描（图5A）和明场显微镜（图5B）检测相同的不规则血管的例子。总之，这数据显示，我们可以分析吨他同一个样品后血管铸型多种成像工具。

图1。整个鼠脑血管铸型。前（a）和（二）澄清水杨酸甲酯溶剂后。船只可以清楚地显示脑表面（A）和实质以下澄清程序（二）。

图2。明视显微镜图像澄清血管铸造大脑。大脑可以在各种飞机和在不同的放大倍率级别成像。比例尺为200μm（A）和50微米（二）。

图3。剖析1倍显微镜图像显示整个成年小鼠大脑cerebrovasculature从背视图。

图4。显微CT扫描相同的整体成年小鼠大脑从背视图图3所示的图像。

图5。血管铸型方法检测脑动静脉畸形中的应用。一）微铸造大脑血管的CT扫描显示区域的扩大，动静脉畸形不规则状大脑右半球的船只，从腹面观。显示在右边的区域放大后的图像（白盒）。 b）同不规则的血管可视化明场显微镜下，在50倍放大倍率。比例尺50微米。

我们在这里报告成年小鼠cerebrovasculature可能与各种方式成像的铸造方法。这种方法应用到疾病模型BAVM，可不规则血管的三维分析。潜在的未来研究包括微型CT图像量化，组织病理分析，诊断血管疾病的进展。

遇到的常见问题及建议

完整的脑血管灌注并不总是能够达到。有足够的压力来达到远端的血管没有破裂的左心房或主动脉是一个挑战。为了克服这个问题，采用一致的压力约为100mmHg。此外，调整针的位置，以确保进入主动脉铸造剂的适当流出。重要的是，颈动脉并不仅限于铸造剂，因此可以达到脑血管。改善小血管每相关的关键步骤融合是：（1）适当的血液从血管结算;（2）过滤铸造剂;（3）在铸造剂注射针的位置。应谨慎，以避免注射铸造成左心房和肺的代理。其他研究者已经成功灌注³小鼠和大鼠⁴ cerebrovasculature无需使用额外的程序。 Microfil灌注血管的手动分析counterstained hemotoxylin显示，93％的血管腔^灌注 5 。务必丢弃或彻底清洁接触铸造剂，因为它会迅速聚合，工具不能用于多个科目使用任何工具。小鼠脑组织周围的澄清是具有挑战性的。沉浸在水杨酸甲酯，仍可能出现不透明的组织，使血管成像困难。确保适当的脱水和澄清，要解决这个问题。在酒精和小号甲基脑组织上放置一个摇杆alicylate治疗，可提高组织的澄清。

该技术的缺点

这项技术的局限性包括：（1）有必要立即注入铸造剂溶液混合后，添加催化剂后，因为它会变粗迅速;（2）铸造剂填充大电导船容易，但它并不可靠填补较小的船只，如动脉（阻力血管）和毛细血管（营养血管），（3）它是不是最好不透X线显微CT成像相比之下，虽然一些群体更喜欢微型^CT成像1,6 Microfil。然而，以下提出上述建议，包括适当的针的位置，船只的位置和灌注压，可实现完整的铸造较小的船只。各种分析工具的适应性使得这个代理一个有价值的工具，分析脑的结构，包括动脉和静脉循环，各种观点。

该技术的应用

这种方法的优点是其广阔的应用潜力。投填充所有船只，包括动脉，静脉和毛细血管身体内的所有组织，因此可以分析不同种类的多个器官的血管结构。此前，其他团体，用于^大 7 ^小 8船只在^人类 9，猴， ^羊 10， ^大鼠 4,11,12， ^小鼠 3,13灌注。我们现在表明使用这一技术在小鼠大脑微血管的结构分析，在健康和^疾病状态，2的证据。此外，还有与灌注的不同大小和不同颜色的的船舶，以提高各器官的血管可视化不同粘度Microfil的解决方案。例如，红色，可以很容易地可视化在苍白的脑实质，和黄的对比以及与暗红色的心肌。此外，视物不透X线，血管，可成像显微CT扫描获得三维旋转图像。该组织也可用于石蜡切片和病理分析后成像。

结论

我们在这里展示一个协议，使一个成年小鼠的大脑，它可以适应使用各种分析技术的研究形态结构的cerebrovasculature血管的血管铸。我们还提供了BAVM疾病状态模型，证明这种方法的应用为代表的扩大，不规则形状的船只，分流的血液从动脉到静脉环流。有多种血管铸型方法可用。简单的协议，这里我们提供了一个血管演员可能被用来作为一种工具来检查使用各种成像方式的成年小鼠大脑血管。

机构的动物护理和美国加州大学旧金山分校（UCSF）使用委员会批准使用实验动物的实验过程。

作者感谢与手稿准备援助伏尔泰Gungab。这项工作是支持的，部分补助：国家卫生研究院（T32 GM008440 EJ沃克，R01 NS27713轮候册年轻，P01 NS44155 WL杨和H.苏），R21 NS070153 H ·苏和美国心脏协会（AHA 10GRNT3130004到H苏）。