Hemorajik Şok modeli travma sonrası inflamasyon ve uç-organ hasarı ile ilişkili sinyal kaskadlar tanımlanması ve anlaşılmasını kolaylaştırmak, güvenilir ve tekrarlanabilir bir kaynak olmuştur. Bu makalede, farelerde Hemorajik Şok deneysel prosedürü ile ilgili cerrahi ve mekanik yönlerini bir adım-adım açıklamasını sağlar.

Ciddi kan kaybı ve travmatik yaralanma (MOD Bu sinyalizasyon olaylar da çoğu zaman ölüm ile sonuçlanan zararlı sinyal olayların zincirleme bir ^{1, 2, 3, 4, 5,} sepsis ve / veya çoklu organ disfonksiyonu yol açabilir yol açabilir ortak bilgi ) ^{6, 7, 8, 9,} travmatik yaralanmalar muzdarip hastalara yardımcı olmak için daha etkili yollar geliştirmek için bastırılmış bağışıklık işlevi ile zararlı sinyalizasyon kaskadlar nedenlerini araştırmak için kritik öneme ^sahiptir. 10 Bu sabit basınç Hemorajik Şok (HS ) prosedürü, teknik açıdan zor olmasına rağmen, bu patofizyolojik koşullarının incelenmesi için mükemmel bir ^{kaynak, 11, 12,} 13 avanslar biyolojik sistemlerin değerlendirilmesi, yani Sistemleri Biyoloji daha karmaşık fizyolojik ağları ve hücresel haberleşme kalıplarını anlamak için bilimsel topluluk ^etkin var . 14 Hemorajik Şok bağışıklık işlevi ile ilgili olarak bu hücresel haberleşme kalıplarını açıklanması için hayati bir araç olduğu kanıtlanmıştır. ^{15, 16, 17, 18} Bu prosedür hakim olabilir! Bu işlem aynı zamanda sabit bir hacim veya sabit basınç yaklaşımı olarak kullanılabilir. Biz bu tekniğin araştırma, doğal ve adaptif immün fonksiyonunu artırmak için fare modeli uyarladı. Farelerde küçük boyutlu HS nedeniyle ^{19, 20, 21} benzersiz zorluklar sunar. Ancak, mevcut olan birçok fare suşları nedeniyle, bu tür biyolojik yanıtların çalışma için benzersiz bir kaynak temsil eder. HS modeli şok diğer biçimleri farklı farklı tepkiler ortaya çıkarır gibi, hücresel haberleşme kalıplarını ve hormonal ve inflamatuar aracı sistemleri, tehlike sinyalleri, yani DAMP ve PAMP upregülasyonu gibi sistemlerin tepkileri eğitim için önemli bir ^{model. 22} , 23 ^{, 24, 25,} transgenik fare suşlarının geliştirilmesi ve özel sinyalizasyon inhibe biyolojik ajanların indüksiyon sinyal iletimi düzenlenmesi, ciddi kan kaybı, yani HS ^ve travma 26 daha sonra aşağı yukarı anlayışımızı aydınlatmak ve ^{değerli fırsatlar,} 27 sunduk ^{, 28, 29, 30.}

HS ve travma ile ilişkili olarak çok sayıda resüsitasyon yöntemleri (R) ^{vardır. 31, 32, 33,} 34, sadece döken üç kez kan hacmi eşit laktat ringer solüsyonu (LR), sabit bir hacmi resüsitasyon yöntemi Bu modelde kullanılan gibi uzak organ hasarı ve sistemik inflamasyon olarak endojen mekanizmalarını çalışma. canlandırma ^{35, 36, 38} Bu yöntem, HS ve ^{travma 38,} 39 etkilerini değerlendiren etkili olduğu kanıtlanmıştır .

1. Çalgı ve Cerrahi Alan Hazırlık:

1. Cihazın hazırlanması.

Tüm cerrahi işlemler aseptik teknikler kullanılarak yapılmaktadır. Bir cerrahi mavi ped ve steril saha pansuman kullanılır. Tüm malzemeler ve araçlar kullanılmadan önce sterilize edilir. 6-0 Dikiş, pamuk uçlu aplikatörler, gazlı bez, kadın-erkek, 3-yollu stopcocks ve aletler otoklavda sterilize edilir. Transdüserler, PE-50, PE-10 tüp Etilen oksit sterilize. 3-yollu stopcocks, şırıngalar ve iğneler steril alınır.

6-0 Dikiş-inç 1 adet (6 adet / hayvan) oyulmuş ve küçük sterilizasyon torbalar içine konur. Pamuk uçlu aplikatörler, 4x4 gazlı bez kareler, ve erkek-erkek, 3-yollu stopcocks küçük veya orta ölçekli sterilizasyon keseleri ve otoklava konur. Her akşam Bizim cerrahi aletler otoklavda sterilize edilir. Antibakteriyel sabun ve musluk suyu kullanarak cerrahisinden sonra yıkanır. Onlar temiz bir cerrahi mavi ped üzerinde kurumasına izin verilir. Daha sonra dikkatli bir şekilde sterilizasyon kese içine yerleştirilir ve ertesi gün kullanmak için sterilize.

Dönüştürücüler ve tüp plastik parçaların sahip olduğu için, gaz, yani Etilen Oksit ile sterilize edilmelidir. PE-10 boru, 5-inç parçalar halinde kesilir ve küçük bir sterilizasyon kese içine yerleştirilir. PE-50 boru, 18-inç parçalar halinde kesilir ve orta sterilizasyon kese içine yerleştirilir.

2. Cerrahi Alan.

Cerrahi saha kurmak için, ilk olarak, bu ameliyatları başlamadan önce uygun sıcaklık 300-350 ° F ulaşmasını sağlamak için sıcak boncuk sterilizatör açmak. Sonra alkol cerrahi mavi pedleri koyarak sonraki adımlara devam benchtop sildi. Bir yastık mikroskop altında gider ve diğer BP analizörleri bulunmaktadır dolaşımdaki ısıtma yastığı gider. Iki cerrahi mavi pedleri üzerinde soyunma steril bir alan yerleştirin. % 70 alkol ile yolu bir paslanmaz çelik alet tepsisi 1 / 3 doldurun. Tüm cerrahi aletlerin karşılamak için yeterli% 70 EtOH kullanın. Ayrı bir steril alanında soyunma kullanın ve mikroskop yanına yerleştirin. Bu steril alan tüm steril aletler, dikiş, gazlı bez ve kateter yerleştirin. Dokunarak onları kontamine steril aletler ve dikiş açarken dikkatli olun. Bu kurulum işlemi yaparken steril eldiven kullanmak en iyisidir.

2. Makina Set-up ve Usulleri:

1. Kateter ayarlayın.

BP, ilk olarak, steril eldiven koymak ölçmek için kullanılan sağ bacak fare kateter set-up. Daha sonra otoklava kese steril PE-10 tüp olsun. Aralarında bir inç hakkında bırakarak işaretçi parmak ve başparmak ile boru ortasında tut. Bu bölümde tüp çapı daha ince kateter yardımcı olmak için biraz gerin. Germe sonra tüp steril makas kullanarak yarısında kesti. 5-inç tüp yaklaşık 2 ½-inç uzunluğunda iki adet olmalıdır. Konik gergin sonunda emin olun.

Bu damar duvarının alt üzerinden alay lümen çıkmadan şansını artırabilir * Çok fazla eğimli kenar açısını yapmayın.

30G iğne boru künt gerilmemiş ucunu takın. Steril bir 1 cc şırınga ve 3-yollu stopcock alın. Alkol silin heparinize salin solüsyonu (0.1ml Heparin/9.9ml Tuzlu) içeren 10cc bir steril flakon üst sterilize etmek için kullanın. Heparin çözüm 0.6-0.7cc şırınga doldurun. 30G iğne ve kateter doğrudan erkek ucunu karşısında 3-yollu sonuna kadar takın. Stopcock, 30G iğne ve heparin solüsyonu ile PE-10 tüp doldurun. Sistem TÜM HAVA BUBBLES OUT almak için emin olun. Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için en etkili yolu, yerçekimi kullanmaktır. Benchtop boru dangle izin verirken yere doğru iğne ucu. Iğne hub parmak hareketiyle verin ve baloncuklar heparin çözüm üst float. 3-yollu 30G iğne çıkarın ve kabarcıkları giderin. 3-yollu sıkışıp varsa kabarcıkları ve 3-yollu boru iliştirmeniz 1cc enjektörün içine 3-yollu arka sıvı çekin. Karışım yaklaşık 1 cc şırınga içinde kalmalıdır. Fare 1U heparin / fare ile ilgili bu karışımın eşit 0.05cc (kateter takılması ile açıklığını korumak için ateş basması sonucu olarak) hakkında alacaksınız. Bu tamamlanmış kateter cerrahi aletler ile soyunma steril alan üzerine yerleştirin.

Için set-up sol bacak fare kateter 3-yollu stopcock dışında yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedürü takip edin. Sol bacak, kan çekmek için kullanılır ve 3-yollu stopcock gerekli değildir. Heparinize salin karışımı 0.15-0.2cc ile başka bir 1 cc steril şırınga doldurun. Kanca kadar 30G iğne ve PE-10 tubi1 cc şırınga doğrudan ng. Çözüm ile bu sol bacak kateter sistemi doldurun. Da, bu sistem kabarcıklarını çıkarın. Tamamlanmış kateter steril aletler ile soyunma steril bir alan üzerine yerleştirin.

2. Transducer ayarlayın.

Mikro-med özelliklerine göre digi-med BPA 400 analizörü steril bir transduser Kanca kadar. Transdüser iki ucunda bir 3-yollu stopcock takın. 10cc şırınga, Ringer solüsyonu (LR) ile doldurun ve dönüştürücü masa üstü düz yalan böylece 3-yollu ekleyin. PE-50 boru 18-inç presterilized hazır kesilmiş parça her iki ucunda bir 23G iğne takın. 10cc şırınga ile bağlı 3-yollu PE-50 hortumun bir ucunu. PE-50 LR ile set-up 3-yollu ve doldurun. Bir önceki bölümde de açıklandığı gibi sistemi TÜM HAVA BUBBLES OUT olsun emin olun. Transdüser 3-yollu yeniden takın ve transdüser ve ^2. LR ile 3-yollu doldurun. Son olarak, sağ bacak fare kateter eki için PE-50 boru 23G iğne metal kadın-erkek leur kilit stopcock takın.

* Bu operasyonda sıvı transdüser kaldığını kritik öneme sahiptir.

* Kalibrasyon ve Micro-med protokolüne göre sıfır prosedürleri izleyin.

3. Cerrahi ve Deneysel Prosedürler:

1. Cerrahi.

Pentobarbitol Sodyum intraperitoneal (Nembutol) (70mg/kg @ 1:10 seyreltme) verilerek başlayın. Bu prosedür, ilk fare kuyruğunu taban (en proksimal uç) kullanarak kafes toplayıp tarafından gerçekleştirilir. Hala kendi kuyruğunu tutarken Ardından, kafesinin üst hayvan. Fare fare forepaws hemen arkasında iki tarafında başparmak ve orta parmak ile boyun ense tut. Parmağı baş hareketsiz bırakması için berduş doğru geri baş / boyun bölgesinde cilt çekmek için kullanılır. Yüzük parmağı fare omurganın bel bölgeye basılı iken farenin kuyruk sonra sarılmış ve küçük parmak ve yüzük parmağı arasında tutulur. Fare, 5 dakika içinde uykuya olmalıdır. Hayvan sonra anestezi yer onların yatar pozisyonda, metal cerrahi levha üzerine. Ekstremitelerde taping hayvanların hareketsiz gevşek döngü bant tekniği kullanılır. Gevşek döngü tekniği sadece ince şerit bant kesme ve gevşek, pençe aşağı ön ekstremitelerin her etrafında ve pençe aşağı arka bacaklarda her etrafında bant sarma gerektirir. Kaset daha sonra kendisine geri sıkışmış ve bant üzerinde sol kuruluna bağlı. Bu farelerin ekstremitelerde daha doğal bir anatomik pozisyonu sağlar. Hayvanın karın ve kasık bölgelerinden sonra Oster A5 clippers boyutu 40 bıçak kullanarak traş edilir. 4x4 gazlı bez betadin doused ve cerrahi alanda daha sonra kısırlık silinir.

Immobilizasyon ve Sterilizasyon sonrasında izofluran 1 cc ile burun konisi ilk kesi yapmadan önce fare birkaç saniye boyunca burnunun üzerine yerleştirilir. 50cc konik tüp gazlı bez ile dolu bir burun konisi oluşur. Tüpün alt yarısı içinde temas etmeden dinlenmek için farenin burnunun için bir alan oluşturarak dışarı kesilir. Izofluran buharlar kaçamaz sağlamak için bir kap (bir doku saklama kabı alt) 50cc konik ucuna yerleştirilir. Hayvanın solunum yavaş başlar sonra, karın ve sol çapraz abdominus kas sol internal oblik kas paralel olarak deride, 4-5mm küçük bir kesi yapılır. Femoral ven ve arter diseksiyonu izler. Çevresindeki kaslar veya dokunmatik sinirler zarar vermemek için emin olun. Bu diseksiyon başlamak için, oblik ve transvers karın kaslarını yağ dokusu, yağ dokusu, karın bağlantı dumonts kapma ayırın. Bu doku, kas duvardan çekin. Sonra, fasya ve adipoz dokuda dumonts diğer çifti kullanılarak uzak alay karın kasları boyunca teşrih künt. Sadece bu yağ dokusu altında femoral sinir ile birlikte femoral ven ve arter yalan.

* Vastus intermedius, medialis ve kuadriseps femoris veya rektus femoris lateralis kası zarar vermemek için emin olun. Bu kaslar kapmak ya da dokunmaya ihtiyaç yoktur.

* Femoral Sinir DOKUNMAYIN

Yanında yer alan yağ dokusu kapma sinir parçalara ayır. Ven ve arter yanal çekin ve bu doku sinir, bu doku içinde gömülü olarak takip edecek. Sinir laterale çekilir gibi, karşı arter, diğer dumonts gelin aşağı yerleştirerek ve açılış ve kapanış onları teşrih fasya künt. Damarları çok yüzeysel değil emin olunaltta yatan kas içine kazmak. Sinir ayrıldıktan sonra, kasları, damarları tutan fasya ayrı dumonts kullanın. Dumonts kapalı tutun ve gemilere dumonts dorsal kayma. Dumonts ucu ven diğer tarafta göründüğü gibi, onları fasya teşrih künt açın. Dumonts dorsal damar tutun ve ilk dikiş kapmak. Dumonts içine koyun ve dikiş dikiş damarları ve altta yatan kasları arasındaki açıklıktan geri çekin. Yine, çevresindeki kas hasarı gerek yoktur.

Ven ve arter etrafında 3 olmak üzere toplam 6-0 sütürler koyun. Sütür 1 karın kasları için en proksimal. Bir düğüm ancak gevşek ve hemostat kapalı bırakın. Hemostat içbükey kenar hayvanın karın boşluğuna geri kalanı gerekir. Sütür 2 yerde en distal. Bu dikiş hemen aşağı tekrar damarları ve hemostated, içbükey tarafı ligating bağlı olabilir. Distal ve proksimal sütür gergin damarları (kan kaybını önlemek için) çekin ve kateter yardımı biraz kaldırmak için kullanılır. Sütür 3 kateter destek dikiş. Distal ve proksimal sütürler arasındaki bu dikiş yerleştirin. Kateter yerleştirildikten sonra geminin içinde güvenliğini sağlamak için kullanılan olacak gevşek bir düğüm. Sütür güvenli sonra, kalın bir damar duvarı arter tanımlar. Bu çok beyaz. Microscissors kullanarak arter üstüne küçük bir kesi olun. Arterin ilk kateter yerleştirilmesi için bol miktarda var bu açığını kapatmak distal sütür olun. Dumonts arter damar lümenine dumonts bir ucunu yerleştirerek ve damar duvarı üzerinde kapanış delik açmak için kullanın. Ilk takıldıktan sonra kateter yerinde tutmak için kullanılır, böylece orta dikiş arteryel delik proksimal emin olun. Kateter boyunca geminin çekerken arter duvarında lümen kateter itin tutarken. Kateter yerinde tutmak için orta destek dikiş hafifçe aşağı bağlar. Proksimal hemostat bırakın. Bu sürüm proksimal sütür gevşetin ve damarları çevresinde dikiş yeniden. Bu noktada, kateter arter basıncı geri kan zorlamalıyız. Titreşimli kateter kan görünür olmalıdır. Kateter etrafında gemilerin bir Dumont ile tutun ve yaklaşık 4-5mm damar içine kateter itmek için kullanabilirsiniz. Holding kateter çevresindeki damar, arter yırtılmasını önlemek için yardımcı olur. Kateterin ucu iç oblik ve transvers abdominus kas altında sadece dinlenmek gerekir. Arteryel hat kan pıhtısı önlenmesi için, kateter içine kan çekmek ve heparinize sıvı demlenmeye fare birkaç kez geri itin. Bilateral femoral arter kanülasyonu için diğer bacak için bu işlemi tekrarlayın. Fizyolojik parametre izlemek için hayvan Kanca, BPA-400 analizörü yani arteryel satırları yıkayın. 1 veya 2 damla steril serum fizyolojik çevreleyen doku nemli tutmak için cerrahi ağzına koyun. Işlem boyunca doymuş bu alanda tutmak için emin olun. Kısırlık korumaya yardımcı olmak için işlem boyunca hayvanın üzerinde soyunma steril bir alan yerleştirin.

% 70 alkol içine yerleştirin ve cerrahi aletler steril gazlı bez ile silin. Hayvanlar arasındaki sterilizasyon için ~ 20 saniye süreyle sıcak boncuk sterilizatör içine koyun. Cerrahi aletler çıkarın ve% 70 alkol ile, onlara serinlemek yardımcı olmak için sprey. Steril ped üzerine yerleştirin. Sonraki hayvanların geri damla olacaktır araçların sol alkol olduğundan emin olun.

2. Hemorajik Şok.

15dk içinde. süre, yaklaşık 1 / 2 fare kan hacmi, 28-32mm Hg, ortalama arter basıncı elde içine kapanık.

* 25-27g fare için ilk istenilen basınç elde etmek için çekilmiş kan hacmi yaklaşık 0.6cc

Bu işlem sabit bir hacmi karşı sabit bir basınç yöntemdir. Bu prosedürler, ancak sabit basınç ve sabit hacim kanama hem de takip edilebilir. Sürekli olarak izlenmekte edilirken, hayvan 1,5 3hours hemorajik şok kalacaktır. Istenilen basınç elde etmek için daha fazla kan geri hayvan telafi etmek için çalışır ve ortalama arter basıncı (BP / HR analizörü ile görünür) biraz tekrar yükselmeye başlar. Takviyeleri (IP 0.05cc Nembutol) nadiren HS işlemi sırasında gerekli olmasına rağmen, hayvan solunum, bıyık hareket, refleks testler, ve dijital BP / HR okuma, bir hayvan anestezi ek ihtiyaç duyduğunda belirlemenize yardımcı olur. ° C Hemorajik Şok prosedür yoluyla Hayvanlar ve 36-37 arasında bir sıcaklık korumaya yardımcı olmak için, dolaşımdaki ısıtma yastığı lambası altında tutulur. Sıcaklık rektal prob ile kontrol edilir.

3. Resüsitasyon.

Şok süre elaps sonraes, hayvan Laktatlı Ringers (LR), 3x her hayvanın kanı hacmi sabit bir ses seviyesinde çözüm kullanarak (R) yeniden hayata. LR hacmi sabit bir hızı, bir 15dk üzerinden ses, dağıtmak için bir şırınga pompası ile yönetilmektedir. aralığı. Kateteri çıkarın ve 3 sütür kullanarak gemilerin Arter. Kateterin proksimal dikiş geçmişte çekin ve tamamen kapalı bu dikiş kravat. Yani herhangi bir kan kaybını önlemek. Kollateral akım iskemik olma arka bacaklarda önler.

4. Rescitation Mesaj.

R sonra her iki arka ekstremite açıklıklar steril 4-0 PDSII dikiş kullanılarak dikilir. Gevşek bir döngü bant kaldırılır ve hayvanların birkaç saat sonrası kurtarma için dolaşan ısıtma yastığı tutulur temiz bir kafes yerleştirilir. Hayvanlar, ağrı düzgün yönetmek için anestezi de uyanmak başlar Analjezik uygulanmalıdır. Buprenorfin (0.1mg/kg) olarak, hayvanların fiziksel aktivite başlamadan subkutan enjekte edilir, fakat önce, böylece solunum fonksiyon ele geçirmesine değil. IACUC onaylı protokol, bireysel hayvan davranışları, ve mevcut tıbbi durumlar garanti gibi agresif bir ameliyat sonrası izleme kullanılması tavsiye edilir.

4. Başarı Sırları:

1. Gemilerin diseksiyon, Femoral Sinir TOUCH değil emin olun.
2. Rektus lateralis rektus femoris, ve vastus medialis kaslarının zarar vermemek için emin olun. Bu kaslar kapmak ya da dokunmaya ihtiyaç yoktur.
3. Bu kadar çok keskin bir kateter eğim açısı Etmeyin kateter lümeni ve kontrolsüz kanama çıkmadan yol açacaktır
4. Mümkün olduğunca steril kalması için ekstra çaba aldığınızdan emin olun.
5. Herhangi bir kateter ya da transdüser sistemleri NO hava kabarcığı olmadığından emin olun.
6. Çalışırken sinyaline LR sıvı olduğundan emin olun. BP sistemi kuru vadede zarar verebilir.
7. Arteryel delik küçük olun.
8. Distal sütür yakın arter delik açın.
9. Aynı zamanda arter ripping önlemek için kateter üzerinde gemi çekerken kateter itin.
10. Kontrolsüz doku hasarı veya sıvı kaybını önlemek için steril serum fizyolojik ile doymuş bacaklarda cerrahi açıklıklar tutmak için emin olun.
11. Sabır ve incelik kritik öneme sahiptir.
12. Deney boyunca hayvan fizyolojisi için dikkatli olun.

5. Operatif Endişeler Mesaj:

1. Bacakta iskemi için kontrol edin. Kollateral akım Bunu önlemek rağmen.
2. Hayvan cerrahi manipülasyon ve ilişkili enflamasyon sonucu olarak arka bacaklarda kullanırken sorun olabilir. Uygun ağrı yönetin.
3. Dokunmak ve daha sonra sinir zarar seferber hayvan yetersizlik yol açabilir.

Hemorajik Şok GM053789 Finansman Kaynağı / Sayı Moleküler Biyoloji