O modelo de choque hemorrágico tem sido um recurso confiável e reprodutível facilitar a identificação e compreensão de cascatas de sinalização associadas com inflamação e lesão de órgãos-final após o trauma. Este artigo fornece uma descrição passo-a-passo de aspectos cirúrgicos e mecânicas associadas com o procedimento de choque hemorrágico experimental em camundongos.

É de conhecimento comum que a perda de sangue severa e lesões traumáticas podem levar a uma cascata de eventos prejudiciais sinalização, muitas vezes resultando em mortalidade. ^{1, 2, 3, 4, 5} Estes eventos de sinalização também pode levar a sepse e / ou disfunção de múltiplos órgãos (MOD ). ^{6, 7, 8, 9} É fundamental então, para investigar as causas da supressão das funções imunológicas e prejudicial cascatas de sinalização a fim de desenvolver formas mais eficazes para ajudar os pacientes que sofrem de lesões traumáticas. ¹⁰ Este choque hemorrágico pressão fixa (HS) procedimento, embora tecnicamente difícil, é um excelente recurso para a investigação destas condições fisiopatológicas. ^{11, 12, 13} Avanços na avaliação de sistemas biológicos, ou seja, Biologia de Sistemas permitiram que a comunidade científica para entender melhor as complexas redes fisiológicas e padrões de comunicação celular. ¹⁴ choque hemorrágico tem provado ser uma ferramenta vital para desvendar esses padrões de comunicação celular como eles se relacionam com a função imunológica. ^{15, 16, 17, 18} Este procedimento pode ser dominado! Este procedimento também pode ser usado tanto como um volume fixo ou abordagem pressão fixa. Nós adaptamos esta técnica no modelo murino para reforçar a investigação em inata e adaptativa a função imunológica. ^{19, 20, 21} Devido ao seu pequeno tamanho HS em camundongos apresenta desafios únicos. No entanto, devido às muitas linhagens de camundongos disponíveis, esta espécie representa um recurso sem precedentes para o estudo das respostas biológicas. O modelo HS é um importante modelo para o estudo de padrões de comunicação celular e as respostas dos sistemas tais como sistemas de mediador hormonais e inflamatórias, e os sinais de perigo, ou seja, DAMP e upregulation PAMP, uma vez que provoca reações distintas que diferem de outras formas de choque. ^{22, 23 , 24, 25} O desenvolvimento de transgênicos cepas murino ea indução de agentes biológicos para inibir a sinalização específica apresentaram oportunidades valiosas para elucidar a nossa compreensão da cima e para baixo regulação da transdução de sinal depois de severa perda de sangue, ou seja, HS e trauma ^{26, 27 , 28, 29, 30.}

Existem métodos de reanimação numerosos (R) em associação com HS e trauma. ^{31, 32, 33, 34} Um método de ressuscitação fixo volume de solução de ringer com lactato apenas (LR), igual a três vezes o volume o sangue derramado, é utilizado neste modelo para estudar mecanismos endógenos, tais como lesões de órgãos remoto e inflamação sistêmica. ^{35, 36, 38} Este método de ressuscitação é provado ser eficaz na avaliação dos efeitos do trauma e HS ^{38, 39.}

1. Instrumento e Preparação do campo cirúrgico:

1. Preparação instrumento.

Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados usando técnicas assépticas. Uma almofada cirúrgica azul e vestir campo estéril são utilizados. Todos os materiais e instrumentos são esterilizados antes do uso. 6-0, aplicadores com ponta de algodão, gazes, macho-macho de 3 vias torneiras, e os instrumentos são esterilizados em autoclave. Transdutores, PE-50 e PE-10 tubos são esterilizados por óxido de etileno. Todas as torneiras de 3 vias, seringas e agulhas estéreis são recebidos.

6-0 é cortado em pedaços de 1 polegada (6 peças / animal) e colocados em sacos de esterilização de pequeno porte. Cotonete aplicadores, praças gaze 4x4, e macho-macho de 3 vias torneiras são colocadas em qualquer pequeno ou médio porte e bolsas de esterilização autoclavado. Nossos instrumentos cirúrgicos são esterilizados em autoclave a cada noite. Eles são lavados após a cirurgia usando sabão antibacteriano e água da torneira. Eles são autorizados a seca em uma almofada cirúrgica limpa azul. Em seguida, são cuidadosamente colocadas em uma bolsa de esterilização e esterilizado para uso no dia seguinte.

Desde os transdutores e tubos têm componentes de plástico, eles devem ser esterilizados com gás, ou seja, Óxido de Etileno. PE-10 tubo é cortado em pedaços de 5 polegadas e colocado em uma bolsa de esterilização de pequeno porte. PE-50 é cortado em tubos de 18 polegadas pedaços e colocados em uma bolsa de esterilização médio.

2. Campo cirúrgico.

Para set-up do campo cirúrgico, primeiro, ligar o esterilizador quente talão para garantir que ele atinja a temperatura adequada-300-350 F ° antes de iniciar as cirurgias. Em seguida, avance para as próximas etapas, colocando cirúrgica almofadas azuis para baixo em um álcool limpou bancada. Um pad vai sob o microscópio eo outro vai para a almofada de aquecimento onde a circulação de analisadores BP estão localizados. Coloque um campo estéril de vestir mais dois blocos cirúrgicos azul. Encha uma bandeja de instrumentos de aço inoxidável 03/01 da maneira com álcool a 70%. Use o suficiente EtOH 70% para cobrir todos os instrumentos cirúrgicos. Use um curativo estéril campo separado e colocá-lo ao lado do microscópio. Coloque todos os instrumentos esterilizados, sutura, gaze, e cateteres neste campo estéril. Tenha cuidado ao abrir instrumentos esterilizados e sutura para não contaminá-los por tocá-los. O melhor é usar luvas estéreis quando se faz este procedimento de instalação.

2. Mecânica Set-up e Procedimentos:

1. Cateter Set-up.

Para configurar o cateter perna direita murino utilizado para medir pressão arterial, primeiro, coloque luvas estéreis. Então pegue a PE-10 estéril tubo da bolsa autoclavado. Agarre o meio do tubo com o dedo indicador eo polegar deixando cerca de um centímetro entre eles. Estiramento desta seção do tubo um pouco para torná-lo mais fino de diâmetro para ajudar com a inserção do cateter. Após o alongamento do tubo cortado ao meio com uma tesoura esterilizada. O tubo de 5 polegadas deve agora ser dois pedaços de aproximadamente 2 ½ polegadas de comprimento. Certifique-se de bisel o fim esticada.

* NÃO ângulo de borda chanfrada demais, pois isso pode aumentar as chances de sair do lúmen picando através da parte inferior da parede do vaso.

Inserir uma agulha 30G na extremidade sem corte unstretched da tubulação. Obter uma seringa estéril 1cc e uma torneira de 3 vias. Use uma compressa com álcool para esterilizar a parte superior do frasco 10cc estéril contendo solução salina heparinizada (0,1 ml Heparin/9.9ml Saline). Encha a seringa com 0,6-0.7cc da solução de heparina. Coloque a agulha 30G e cateter para o final do 3-way que está diretamente em frente à final masculina. Preencha a torneira, agulha 30G, e PE-10 tubos com a solução de heparina. Certifique-se que para obter todas as bolhas de ar do sistema. A maneira mais eficaz para remover todas as bolhas de ar é usar a gravidade. Aponte a agulha em direção ao chão, deixando a tubulação para balançar a bancada. Dê o hub agulha um movimento dos dedos e as bolhas vão flutuar para o topo da solução de heparina. Remova a agulha 30G do 3-way e remover as bolhas. Retirar líquido na parte de trás de 3 vias com a seringa 1cc para remover quaisquer bolhas que estão presos no 3-way e recolocar o tubo para o 3-way. Cerca de 1cc da mistura deve permanecer dentro da seringa. O mouse irá receber cerca de 0.05cc desta mistura (como resultado da lavagem do cateter para manter a permeabilidade após a inserção) equivale a cerca de 1U heparina / mouse. Coloque este cateter preenchido no campo esterilizado vestir com os instrumentos cirúrgicos.

Para configurar o cateter perna esquerda murino siga o mesmo procedimento como descrito acima, com exceção da torneira de 3 vias. A perna esquerda é usada para desenhar o sangue ea torneira de 3 vias não é necessária. Encha uma outra seringa estéril 1cc com 0,15 0.2cc da mistura salina heparinizada. Ligar a agulha 30G e PE-10 tubing diretamente para a seringa 1cc. Preencha este sistema de cateter perna esquerda com a solução. Remova as bolhas a partir deste sistema, também. Coloque o cateter preenchido no campo esterilizado vestir com os instrumentos esterilizados.

2. Transdutor de Set-up.

Ligar um transdutor estéril para o digi-med BPA 400 analisador de acordo com as especificações micro-med. Adaptar uma torneira de 3 vias em ambos os lados do transdutor. Encher uma seringa 10cc com solução de Ringer Lactato (LR) e anexá-lo ao 3-way para o transdutor vai deitado na bancada. Inserir uma agulha 23G em ambas as extremidades do pedaço de precut esterilizado de 18 polegadas PE-50 tubos. Prenda uma extremidade do tubo PE-50 para o 3-way com a seringa de 10cc em anexo. Preencher o 3-way e PE-50 set-up com LR. Certifique-se que para obter todas as bolhas de ar do sistema como descrito na seção anterior. Recolocar o 3-way para o transdutor e encher o ^nd transdutor e 2 de 3 vias com LR. Por último, coloque o metal macho-macho torneira leur lock-à agulha 23G da tubagem PE-50 para fixação do cateter perna direita murino.

* É fundamental que o fluido permanecer no transdutor, quando em operação.

* Siga calibração e zero procedimentos de acordo com a Micro-med protocolo.

3. Procedimentos cirúrgicos e Experimental:

1. Procedimentos Cirúrgicos.

Começar pela administração de uma injeção intraperitoneal de sódio Pentobarbitol (Nembutol) (70mg/kg @ diluição de 1:10). Este procedimento é realizado, primeiramente, escolher o mouse para cima de sua jaula usando a base (extremidade mais proximal) de sua cauda. Em seguida, coloque o animal em cima da gaiola enquanto ainda segurando sua cauda. Agarrar a nuca do pescoço do mouse com o polegar eo dedo médio de cada lado do mouse logo atrás da patas dianteiras. O dedo indicador é usado para puxar a pele na região da cabeça / pescoço em direção à nuca para imobilizar a cabeça. Cauda do rato é então envolto e realizada entre o dedo mindinho e do dedo anelar enquanto o dedo anelar é pressionado para a região lombar da coluna vertebral do rato. O mouse deve estar dormindo dentro de 5 minutos. Depois o animal é anestesiado lugar-los para a placa de metal cirúrgica em posição supina. A técnica de fita solta loop é usado para imobilizar os animais gravando suas extremidades. A técnica de laço solto implica simplesmente cortar tiras finas de fita e envolver a fita frouxamente em torno de cada um dos membros dianteiros inferior à pata e em torno de cada um dos membros posteriores inferior à pata. A fita é então preso de volta para si e os que sobraram de fita está conectada à placa. Isto permite que as extremidades dos camundongos a assumir uma posição anatômica mais natural. Áreas abdominal e inguinal do animal são, então, raspada usando Oster A5 tamanho clippers 40 blade. A gaze 4x4 é adocicada com betadine e da área cirúrgica é, então, limpou para a esterilidade.

Após imobilização e esterilização, um cone de nariz com 1cc de isoflurano é colocado sobre o nariz do mouse por alguns segundos antes de fazer a incisão inicial. O cone do nariz consiste de um tubo cônico 50cc preenchido com gaze. Metade do fundo do tubo é cortado criando um espaço para o nariz do rato para descansar dentro sem contato. A tampa (fundo de um recipiente de armazenamento de tecido) é colocado no final da cônica 50cc para garantir os vapores isoflurano não escapam. Uma vez que o animal respirações começam a diminuir, uma incisão de 4 5 milímetros pequeno é feito na pele paralelo ao músculo oblíquo interna esquerda do abdômen e do músculo abdominal transverso esquerdo. Dissecção da veia femoral e da artéria segue. Certifique-se de não danificar os músculos que rodeiam ou nervos toque. Para começar essa dissecação, separar o tecido adiposo dos músculos oblíquos e transverso abdominal, agarrando o tecido adiposo com o dumonts na conexão abdominal. Puxe o tecido de distância da parede muscular. Então, blunt dissecar ao longo dos músculos abdominal provocando longe fáscia e tecido adiposo com o outro par de dumonts. Logo abaixo deste tecido adiposo mentira a veia femoral e da artéria junto com o nervo femoral.

* Cuidado para não danificar o vasto intermédio, medial e lateral do músculo do quadríceps femoral ou o reto femoral. Não há realmente nenhuma necessidade de pegar ou mesmo tocar esses músculos.

* Não toque o nervo femoral

Dissecar o nervo fora, agarrando o tecido adiposo que se encontra ao lado dele. Puxe este tecido lateralmente da veia e artéria eo nervo seguirá como está incorporado neste tecido. Como o nervo é puxado lateralmente, blunt dissecar o fascia, colocando o dumonts, apontam para baixo, contra a artéria e abertura e fechamento delas. Os vasos são muito superficiais para ter certeza de nãoescavar os músculos subjacentes. Após o nervo é separado, use o dumonts para separar a fáscia segurando os vasos para os músculos. Manter o dumonts fechada e desliza o dorsal dumonts aos vasos. Como a ponta do dumonts aparece do outro lado da veia, abri-los para blunt dissecar a fáscia. Manter o dorsal dumonts ao navio e pegue a primeira sutura. Coloque a sutura no dumonts e puxe o fio para trás através da abertura feita entre os vasos e os músculos subjacentes. Novamente, não há necessidade de qualquer dano muscular circundante.

Coloque um total de 3, 6-0 ao redor da veia e artéria. Sutura 1 é o mais proximal para os músculos abdominais. Dê um nó, mas deixá-lo solto e hemostat-lo. A borda côncava da hemostat deve descansar na cavidade abdominal do animal. Sutura 2 é o mais distal no local. Esta sutura pode ser amarrado imediatamente ligadura dos vasos e hemostated, mais uma vez o lado côncavo para baixo. As suturas proximal e distal são usados ​​para puxar as embarcações taut (para evitar a perda de sangue) e levantá-los um pouco para ajudar na inserção do cateter. Sutura 3 é uma sutura de suporte do cateter. Coloque este sutura entre as suturas proximal e distal. Dê um nó frouxo que vai ser usado para proteger o cateter dentro do vaso após a inserção. Após as suturas são seguras, identificar a artéria da parede do vaso de espessura. É muito branco. Fazer uma pequena incisão na parte superior da artéria usando o microtesoura. Faça um buraco perto da sutura distal para que haja uma ampla quantidade de artéria para a inserção do cateter inicial. Use o dumonts para abrir o buraco, colocando um fim do dumonts no lúmen do vaso arterial e fechá-los sobre a parede do vaso. Certifique-se a sutura proximal do meio é para o buraco arterial para que possa ser usada para manter o cateter no lugar após a inserção inicial. Enquanto segura a parede arterial empurrar o cateter no lúmen enquanto puxa a embarcação durante o cateter. Levemente amarrar a sutura de suporte do meio para manter o cateter no local. Solte o hemostat proximal. Esta versão vai soltar a sutura proximal e reabrir a sutura ao redor dos vasos. Neste ponto, a pressão arterial deve empurrar o sangue de volta para o cateter. Sangue pulsando deve ser visível no cateter. Manter os vasos ao redor do cateter com um dumont e usar as outras para empurrar o cateter dentro do vaso cerca de 4-5mm. Segurando o navio ao redor do cateter ajuda a prevenir a ruptura da artéria. A ponta do cateter deve descansar logo abaixo da musculatura abdominal oblíquo interno e transverso. Para a prevenção de coágulos sanguíneos na linha arterial, retirada de sangue no cateter e empurrá-lo de volta para o mouse várias vezes para infundir líquidos heparinizado. Repita este procedimento para a outra perna para canulação da artéria femoral bilateral. Gancho do animal até o monitor de parâmetros fisiológicos, ou seja, o analisador de BPA-400 e lave as linhas arterial. Coloque 1 ou 2 gotas de solução salina estéril para a abertura cirúrgica para manter a umidade do tecido circundante. Certifique-se de manter esta área saturada durante todo o procedimento. Coloque um campo estéril curativo sobre o animal durante todo o procedimento para ajudar a manter a esterilidade.

Coloque instrumentos cirúrgicos em álcool 70% e limpe-os com gaze estéril. Colocá-los para dentro do esterilizador quente talão de ~ 20 segundos para esterilização entre os animais. Remover os instrumentos cirúrgicos e pulverizá-los com álcool 70% para ajudá-los a se refrescar. Coloque-os sobre o bloco estéril. Certifique-se que não há álcool deixou sobre os instrumentos que vai pingar de volta para os animais que vem.

2. Choque hemorrágico.

Mais de um 15min. prazo, cerca de 1 / 2 do volume do rato o sangue é retirado atingir uma pressão arterial média de 28-32mm Hg.

* Para um mouse de 25 27g o volume inicial de sangue retirado para alcançar a pressão desejada é de aproximadamente 0.6cc

Este procedimento é um método de pressão fixos em oposição a um volume fixo. Esses procedimentos podem, no entanto, ser seguido tanto para pressão fixa e hemorragia volume fixo. Apesar de ser constantemente monitorado, o animal irá permanecer em estado de choque hemorrágico de 1,5 3 horas. Como o animal tenta compensar e da pressão arterial média começa a subir novamente ligeiramente (visível através do analisador de BP / HR) retirar mais sangue para alcançar a pressão desejada. Embora os suplementos (0.05cc IP Nembutol) são raramente necessárias durante o processo de HS, da respiração animal, movimento bigode, testes de reflexo, e os de leitura digital, BP / HR irá ajudar a determinar quando um animal precisa de um suplemento da anestesia. Animais são mantidos sob a lâmpada e uma almofada de aquecimento circulando para ajudar a manter uma temperatura de 36-37 ° C através do procedimento de choque hemorrágico. Temperatura é verificado através de uma sonda retal.

3. Ressuscitação.

Após o tempo de choque Elapses, o animal é ressuscitado (R) com Lactato de Ringer (LR) solução a um volume fixo de 3x o volume de sangue de cada animal derramado. O volume LR é administrado através de um conjunto de bomba de seringa para dispensar, a uma taxa constante, o volume de mais de um 15min. intervalo. Remover o cateter e ligadura dos vasos usando os 3 suturas. Puxe o cateter apenas após a sutura proximal e gravata desta sutura completamente desligado. Isso vai evitar qualquer perda de sangue. Fluxo colateral impede a membros posteriores de se tornar isquêmico.

4. Pós Rescitation.

Após R ambas as aberturas dos membros posteriores são costurados até usando sutura estéril PDSII 4-0. A fita de laço solto é removido e os animais são colocados em uma gaiola limpa, que é mantido em uma almofada de aquecimento circulando para recuperação de várias horas após. Analgésico deve ser administrado como os animais começam a acordar da anestesia para gerir adequadamente a dor. Buprenorfina (0.1mg/Kg) é injetado por via subcutânea, os animais começam a atividade física, mas não antes, de modo a não comprometer a função respiratória. Utilização da monitorização agressiva pós-operatório conforme garantido pelo IACUC protocolo aprovado, os comportamentos individuais dos animais, e as actuais condições médica é recomendada.

4. Segredos para o sucesso:

1. Ao dissecar os vasos, não se esqueça de tocar o Nervo Femoral
2. Cuidado para não danificar o reto femoral, reto lateral, e os músculos vasto medial. Não há realmente nenhuma necessidade de pegar ou mesmo tocar esses músculos.
3. Não faça o ângulo do chanfro do cateter muito afiada como isso vai levar ao cateter sair do lúmen e hemorragia descontrolada
4. Certifique-se de fazer o esforço extra para permanecer tão estéril quanto possível.
5. Certifique-se que não há bolhas de ar em qualquer um dos sistemas de cateter ou transdutor.
6. Certifique-se de ter fluido LR em transdutor enquanto ele estiver em operação. A funcionar a seco pode danificar o seu sistema de PA.
7. Fazer o buraco arterial de pequeno porte.
8. Fazer o buraco arterial ao nível da sutura distal.
9. Empurre cateter, ao mesmo tempo puxando navio sobre ele para inserção de cateter para evitar que rasga a artéria.
10. Certifique-se de manter as aberturas cirúrgicas nas pernas saturada com solução salina estéril para evitar dano tecidual descontrolado ou perda de líquido.
11. Paciência e delicadeza são críticos.
12. Preste muita atenção para a fisiologia do animal durante o experimento.

5. Preocupações pós operativo:

1. Verificar se há isquemia na perna. Embora o fluxo colateral deve evitar isso.
2. Animal pode ter problemas ao usar membros posteriores como resultado da manipulação cirúrgica e inflamação associadas. Controlar a dor de forma adequada.
3. Tocar e, posteriormente, danificando o nervo pode levar à incapacidade do animal de mobilização.

Biologia financiamento Source / Número Molecular de choque hemorrágico GM053789