Количественная оценка клеточной механики, которая управляет ангиогенезом в 3D-живых тканях, все еще сложна, но все же необходима для продолжения прогресса в области регенеративной медицины. Этот протокол делает задачу более доступной, сочетая доступность 2D-количественных методов с репрезентативностью 3D-тканей. Существующие методы количественной оценки клеточных сил во время ангиогенного прорастания в живых тканях ограничены сложными и вычислительно затратными 3D-выводами сил.
Наш протокол соединяет управление in vitro с актуальностью in vivo за счет адаптации микроскопии тракционной силы для систем X-vivo, предлагая простой в использовании, но физиологически релевантный метод пространственно-временной механической характеристики силы. 2 Модель Nav-D сохраняет физиологический контекст, позволяя проводить количественный анализ клеточной механики, предлагая уникальный подход к изучению механики, управляющей ангиогенезом прорастания. Для начала нанесите пипеткой по 120 микролитров раствора связующего силана в каждую лунку стеклянного дна, 12-луночную пластину.
Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации трижды промойте лунки абсолютным этанолом с помощью пульверизатора, просушите пластину с помощью газообразного азота. Нанесите пипеткой 11,5 микролитров свежеприготовленной смеси полиакриламида или геля ПАА на стеклянное дно каждой лунки.
Аккуратно наденьте 13-миллиметровую крышку поверх каждой капли. После полимеризации добавьте в лунку PBS. С помощью изогнутой иглы аккуратно ослабьте покровный листок от геля PAA.
Затем с помощью пинцета снимите покровное стекло с лунки. Добавьте 75 микролитров одного миллиграмм на миллилитр сульфаниламидной сампы, растворенной в ультрачистой воде, в гели ПАА. Поместите пластину под ультрафиолетовое излучение 365 нанометров на пять минут.
Быстро смойте сульфаниламидную сампу на гелях с PBS. Затем промойте функционализированные гели PAA два раза PBS по 10 минут каждый. Нанесите пипеткой 50 микролитров раствора коллагена 4 на функционализированные гели PAA и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.
На следующий день промойте гели два раза PBS и дайте им высохнуть в течение пяти минут. Добавьте 50 микролитров эндотелиальных клеток для роста клеток или среды ЭКГ поверх гелей. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа.
Для начала с помощью стерильного хирургического пинцета перенесите сонную артерию свиньи из транспортной бутылки, содержащей модифицированный раствор CREB, в большую чашку Петри, наполненную стерильным PBS. Удалите излишки ткани, окружающей сонную артерию, с помощью хирургического пинцета и скальпеля. Отрежьте два-три сантиметра с обоих концов артерии с помощью скальпеля, чтобы устранить участки вблизи бифуркаций артерий.
С помощью тонкого пинцета с круглым концом и скальпеля удалите артериальную фасцию, окружающую сонную артерию. С помощью пинцета перенесите очищенную сонную артерию в новую большую чашку Петри, наполненную PBS. Разрежьте артерию на кольца шириной примерно два миллиметра.
Затем переложите кольца в предварительно разогретую маленькую чашку Петри, содержащую среду для ЭКГ. Поместите кольца при температуре 37 градусов по Цельсию. Для начала, используя пинцет с круглым концом, перенесите кольцо сонной артерии свиньи из средней ЭКГ в чашку Петри среднего размера, заполненную PBS.
С помощью пинцета с круглым концом и скальпеля разрежьте кольцо пополам, затем рассеките половину кольца на листы шириной примерно два миллиметра, чтобы создать артериальные листы размером два на два миллиметра. С помощью пинцета с круглым концом удерживайте артериальный лист сзади и расположите лист на краю геля PAA так, чтобы эндотелиальная внутренняя оболочка была обращена к субстрату PAA. Далее с помощью пинцета аккуратно переместите артериальный лист к центру гидрогеля ПАА, не касаясь геля.
Добавьте 50 микролитров среды ЭКГ поверх артериального листа, следя за тем, чтобы капля оставалась на геле. С помощью пинцета с круглым концом поместите сухой 13-миллиметровый покровный лист поверх артериального листа на субстрат из ПАА в среде. Используйте внутренний край стеклянного дна, чтобы осторожно опустить крышку, пока под нее не растечется средняя капля.
Дайте ткани прикрепиться при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти часов. После этого добавьте по одному миллилитру среды ЭКГ в каждую лунку. Инкубируйте артериальный слой на субстрате ПАА при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
На следующий день с помощью изогнутой иглы осторожно приподнять покровный лист и снять его с артериального листа пинцетом. Удалите среду из лунки и окружающих тканей с помощью вакуумного отсоса, не касаясь тканей, добавьте на каждый артериальный лист каплю 10 микролитров гелевой смеси коллагена типа 1. Дайте гелю полимеризоваться в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
После инкубации аккуратно добавьте в каждую лунку по одному миллилитру предварительно подогретой ЭКГ-среды. Перенесите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 24 часа. Повышенная эффективность крепления артериальных листов наблюдалась при использовании 13-миллиметрового необработанного покровного стекла, что сводило к минимуму усилия при его удалении.
После 24 часов культивирования сонной артерии свиньи в системе 2,5D проверьте наличие прорастающего ангиогенеза. Если наблюдается прорастающий ангиогенез, обновите среду ЭКГ и поместите 12-луночный планшет в держатель предметного стекла в предварительно нагретую инкубационную коробку микроскопа при температуре 37 градусов Цельсия. Выберите объектив микроскопа в зависимости от потребностей в визуализации.
Установите время экспозиции и отрегулируйте плоскость фокусировки с помощью фазово-контрастной визуализации. Затем добавьте флуоресцентный канал для визуализации флуоресцентных шариков и снова установите время экспозиции. Выберите несколько областей интереса в образце и отрегулируйте плоскость фокусировки для каждого положения.
Определите интересующий вас интервал времени, выбрав временной интервал от 5 до 20 минут и продолжительность от 4 до 24 часов. Включите систему фокусировки, чтобы поддерживать стабильный фокус на протяжении всей цейтраферной съемки. Далее для микроскопии силы вытяжения добавьте в лунку 5%SDS в ультрачистую воду и подождите несколько минут, пока отросшие клетки отсоединятся.
Соберите стек флуоресцентных маркеров Z в подложке PAA для каждой выбранной позиции, чтобы получить расслабленное состояние флуоресцентных маркеров в качестве эталонного изображения. Используя настраиваемые коды MATLAB, выберите покадровые и референсные изображения для обработки изображений и определите параметры для анализа. Выравнивайте и обрезайте покадровые изображения относительно лучшего эталонного изображения для точного анализа.
Измерьте смещение флуоресцентных маркеров в гидрогеле ПАА, выполнив асимметрию изображения частиц между покадровым изображением и эталонным изображением. Настройте анализ асимметрии изображений на разделение изображений на окна опроса размером 32 на 32 пикселя с перекрытием 0,5. Наконец, рассчитайте силы сцепления ячеек на основе механических свойств геля PAA.
В рамках 2,5D и 3D моделей артериального листа свиньи наблюдалось образование клеточных ростков, напоминающих ангиогенные паттерны, в то время как 2D модель не показала ангиогенеза прорастания. Жесткость мягкого субстрата гидрогеля PAA способствовала раннему ангиогенезу артериального прорастания по сравнению с более жестким субстратом PAA, демонстрируя эффекты жесткости матрицы. Микроскопия силы тяги показала, что клеточные ростки проявляют тяговые силы на выступах и толкающие силы вдоль оси ростка, приводимые в движение ведущими и ведомыми клетками.
