3次元生体組織における血管新生の発芽を駆動する細胞力学の定量化は、まだ困難であり、再生医療の分野で進歩し続けるためには必要なことです。このプロトコルは、2D定量法のアクセシビリティと3D組織の表現性を組み合わせることで、タスクをより親しみやすいものにします。生体組織における血管新生発芽中の細胞力を定量化するための既存の方法は、複雑で計算コストの高い3D力の推論に限定されています。
当社のプロトコールは、X-vivoシステム用の牽引力顕微鏡を適応させることにより、in vivo関連性のあるin vitro制御をブリッジし、空間的な時間的機械的力の特性評価に使いやすく、かつ生理学的に関連性のある方法を提供します。2 Nav-Dモデルは、細胞力学の定量的分析を可能にしながら生理学的文脈を保持し、発芽血管新生を促進する力学を研究するための独自のアプローチを提供します。まず、120マイクロリットルの結合シラン溶液をガラス底の12ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。
プレートを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、スプレーボトルを使用して無水エタノールでウェルを3回洗浄し、窒素ガスを使用してプレートを乾燥させます。新たに調製したポリアクリルアミドまたはPAAゲル混合物の11.5マイクロリットルを各ウェルのガラス底にピペットで移します。
各液滴の上に13ミリメートルのカバースリップをそっと置きます。重合後、PBSをウェルに加えます。曲げた針を使用して、PAAゲルのカバースリップをそっと緩めます。.
次に、ピンセットを使用して、ウェルからカバースリップを取り外します。サルファサンパ1ミリリットルあたり1ミリグラムの75マイクロリットルをPAAゲルに超純水に溶解します。プレートを365ナノメートルの紫外線の下に5分間置きます。
ゲルの上のサルファサンパをPBSですばやくすすぎます。次に、官能基化PAAゲルをPBSで2回、それぞれ10分間洗浄します。50マイクロリットルのコラーゲン4溶液を官能基化PAAゲルにピペットで移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、ゲルをPBSで2回洗い、5分間乾燥させます。ゲルの上に50マイクロリットルの内皮細胞増殖またはECG培地を追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。
まず、滅菌外科用ピンセットを使用して、修飾CREB溶液を含む輸送ボトルからブタ頸動脈を滅菌PBSで満たされた大きなペトリ皿に移します。頸動脈を囲む余分な組織を、外科用ピンセットとメスを使用して取り除きます。メスを使用して動脈の両端から2〜3センチを切り取り、動脈の分岐部の近くの場所を取り除きます。
細い丸いピンセットとメスの助けを借りて、頸動脈を囲む動脈筋膜を取り除きます。ピンセットを使用して、洗浄した頸動脈をPBSで満たされた新しい大きなシャーレに移します。動脈を約2ミリメートル幅のリングに切断します。
次に、リングをECG培地を含む予熱済みの小さなペトリ皿に移します。リングを摂氏37度に置きます。まず、丸いピンセットを使用して、ブタの頸動脈リングをECGミディアムからPBSで満たされた中型のペトリ皿に移します。
丸いピンセットとメスを使って、リングを半分に切り、リングの半分を約2ミリメートル幅のシートに解剖して、2×2ミリメートルの寸法の動脈シートを作成します。丸いピンセットを使用して、動脈シートを後ろに保持し、内皮の内壁をPAA基質に向けてシートをPAAゲルの端に配置します。.次に、ピンセットを使用して、ゲルに触れずに動脈シートをPAAヒドロゲルの中心にゆっくりと動かします。
動脈シートの上に50マイクロリットルのECG培地を追加し、液滴がゲルに残るようにします。先端が丸いピンセットを使用して、培地のPAA基板上の動脈シートの上に乾いた13ミリメートルのカバースリップを置きます。ガラス底の内側の縁を使用して、中程度の液滴が下に広がるまでカバースリップを静かに下げます。
ティッシュを摂氏37度と二酸化炭素5%で5時間接着します。その後、各ウェルに1ミリリットルのECG培地を追加します。PAA基質上の動脈シートを摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。
翌日、曲がった針を使用して、カバースリップを慎重に持ち上げ、ピンセットで動脈シートから取り出します。組織に触れずに真空吸引を使用してウェルと周囲の組織から培地を取り出し、コラーゲン1型ゲル混合物の10マイクロリットルの液滴を各動脈シートに加えます。ゲルを摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間重合させます。
インキュベーション後、予熱した心電図培地1ミリリットルを各ウェルに静かに加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに24時間移します。13mmの未処理のカバースリップを使用すると、動脈シートの取り付け効率が向上し、取り外し時の力が最小限に抑えられました。
2.5Dシステムでのブタ頸動脈培養の24時間後、発芽血管新生を確認します。発芽血管新生が観察された場合は、ECG培地をリフレッシュし、12ウェルプレートを顕微鏡の摂氏37度に予熱したインキュベーションボックス内のステージホルダーに置きます。イメージングのニーズに基づいて顕微鏡対物レンズを選択してください。
露光時間を設定し、位相差イメージングを使用してフォーカス面を調整します。次に、蛍光ビーズのイメージング用の蛍光チャンネルを追加し、露光時間を再度設定します。サンプル内の複数の関心領域を選択し、各位置の焦点平面を調整します。
5 分から 20 分の時間間隔と 4 時間から 24 時間の期間を選択して、対象のタイムラプスを定義します。フォーカスシステムをオンにすると、タイムラプス撮影全体で安定したピントが維持されます。次に牽引力顕微鏡では、超純水に5%SDSをウェルに加え、成長細胞が剥離するまで数分待ちます。
選択した各位置についてPAA基板中の蛍光マーカーのZスタックを取得し、蛍光マーカーのリラックスした状態を基準画像として取得します。カスタマイズされた MATLAB コードを使用して、画像処理用のタイムラプス画像と参照画像を選択し、解析用のパラメーターを定義します。タイムラプス画像を最適な参照画像に対して位置合わせしてトリミングし、正確な分析を行います。
タイムラプス画像と参照画像との間の粒子画像ベル非対称性を実行することにより、PAAハイドロゲル内の蛍光マーカーの変位を測定します。イメージ ベル非対称解析を構成して、イメージを 32 x 32 ピクセルのインテロゲーション ウィンドウに分割し、オーバーラップが 0.5 になるようにします。最後に、PAAゲルの機械的特性に基づいて細胞牽引力を計算します。
ブタ動脈シートの2.5Dモデルと3Dモデルでは、血管新生パターンに似た細胞芽の形成が観察されましたが、2Dモデルでは発芽血管新生は見られませんでした。PAAハイドロゲルの柔らかい基質の剛性は、より硬いPAA基質と比較して、初期の動脈発芽血管新生を促進し、マトリックス剛性効果を示しています。牽引力顕微鏡法により、細胞芽は、リーダー細胞とフォロワー細胞によって駆動される突起を引っ張る力と芽軸に沿って押す力を示すことが明らかになりました。
