Организмы демонстрируют огромное разнообразие в своих формах. Нас очень интересуют молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе формирования, диверсификации и эволюции этих форм. Чтобы понять это, мы исследовали, как клетки формируют окончательную форму ноги взрослого человека у дрозофилы.
Используя живую визуализацию, мы обнаружили неожиданно удивительное поведение клеток. Во время формирования окончательной формы ноги эпителиальные клетки временно образовали специальную структуру, которую мы назвали парфеноновской структурой. Эта структура, по-видимому, является общей особенностью эпителиальных клеток, поскольку они устанавливают свою окончательную форму. Для долгосрочной визуализации в реальном времени на стадии куколки важно удалять пупарий, сохраняя при этом влажность.
Наш метод, в котором используется тарелка со стеклянным дном и капля воды, стабилен, надежен и прост в обращении даже для новичков. Наши результаты показывают, что клетки претерпевают неожиданные динамические изменения формы во время окончательного процесса формирования формы. Чтобы точно понять механизмы формирования окончательной формы, важно тщательно усвоить непрерывные изменения в форме клетки и исследовать механизмы, стоящие за этими изменениями, и их важность для морфогенеза.
Следующие вопросы, на которые мы хотим ответить, заключаются в том, как структура, подобная Парфенону, формируется временно, и как она способствует формированию более тонкой формы. Для начала соберите из флаконов белые куколки нужного штамма Drosophila melanogaster и поместите их в посуду или пустые флаконы с помощью кисти. Инкубируйте собранных белых куколок при температуре 25 градусов Цельсия в течение не менее 14 часов, пока они не достигнут желаемой стадии для наблюдения.
С помощью кисти, смоченной в дистиллированной воде, аккуратно удалите клей и корм от мух с поверхности пупария. Затем поместите очищенных куколок на чистящие салфетки и оставьте их на несколько минут для высыхания. Теперь прикрепите кусок двустороннего скотча к предметному стеклу и положите высушенные куколки на двусторонний скотч брюшной стороной вниз.
С помощью высушенной кисти аккуратно надавите на тыльную сторону куколок, чтобы улучшить адгезию к двустороннему скочу. Под стереомикроскопом с помощью пары щипцов осторожно вскройте оперкулум пупария. Введите один кончик щипцов в пространство между куколкой и пупарием от края вскрытого оперкулума.
Затем с помощью щипцов возьмитесь за пупарий и потяните его наружу до тех пор, пока он не раскроется. Поднимите оторванные фрагменты пупария и приклейте их к двустороннему скотчу. Для начала подготовьте ногу куколки Drosophila melanogaster к визуализации.
В зависимости от используемого объектива нанесите один микролитр дистиллированной воды или силиконового масла на дно стеклянной посуды. Затем смочите кисть в дистиллированной воде и аккуратно зачерпните куколку. Положите куколку брюшной стороной вниз на дистиллированную воду или силиконовое масло в миску.
С помощью микропипетки добавьте 10 микролитров дистиллированной воды возле края стеклянной части посуды. С помощью шприца нанесите круг силиконовой смазки по краю стеклянной части посуды. Затем наденьте крышку на силиконовую смазку, чтобы закрыть посуду.
После включения конфокального микроскопа и программного обеспечения поместите стеклянную донную чашку с куколкой на предметный столик микроскопа и сделайте изображение нужной области интереса. Эпителиальные клетки в лапке образовали апикобазальные базальные выступы и базальные соединения, которые напоминают Парфенон между 16 часами и 27,5 часами после образования пупария. Прогрессирующее уменьшение толщины эпителия наблюдалось в период от 41 часа до 60 часов после образования пупария, даже после того, как контур ткани ноги стал более четким.
