Введение.Первичные гепатоциты являются важным инструментом для исследований печени in vitro. Тем не менее, экспансия и поддержание этих клеток исторически было сложной задачей, поскольку они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре. 3D-органоиды являются передовым инструментом, способным рекапифицировать ткани в чашке для долгосрочного культивирования, преодолевая проблему неспособности к экспансии до первичных гепатоцитов in vitro.
Общая цель настоящей работы состоит в том, чтобы описать в исчерпывающем, подробном и последовательном протоколе важнейшие этапы перфузии печени крыс и выделения первичных гепатоцитов, чтобы позволить исследователям ускорить и оптимизировать 3D-культуру органоидов на теплой водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия, а затем поместить перфузионный буфер и одну пару PBS в водяную баню на 20 минут. Поместите первичные гепатоциты в полную среду и PBS, добавив 3% пен-шприц на лед. Подготовьте перистальтический насос и соедините трубку со стеклянной бутылкой и пузырьковой ловушкой, обе из которых заполнены перфузионным буфером.
Наполните трубку теплым перфузионным буфером, чтобы удалить пузырьки воздуха и смыть остатки этанола. Обезболивала взрослую крысу путем внутрибрюшинного введения смеси анестетика. Побрейте брюшную полость и очистите ее с помощью этанола на 70%, чтобы уменьшить бактериальное загрязнение во время операции.
Поместите крысу в середину лотка для вскрытия и закрепите конечности с помощью игл. Сделайте U-образный разрез через кожу и мышцу, от центра нижней части живота, к грудной клетке. Зажмите кожу и сложите ее до самой головы, обнажив кишечник.
Осторожно переместите кишечник в левую сторону животного, из брюшной полости, и обнажите воротную вену печени и полую вену. С помощью плоскогубцев проведите шов под воротной веной и подготовьте два узла, один сантиметровый, один от другого, которые окружают саму вену. Введите от 100 до 150 единиц гепарина, растворенного в PBS, в оболочку полой вены, чтобы предотвратить свертывание крови.
Включайте насос с низкой скоростью вращения. Введите ангиокат 18-го калибра в воротную вену, на уровне нити под плоским углом относительно вены. Удалите внутреннюю иглу, чтобы оставить канюлю в вене.
Подсоедините его к выходному концу с помощью разъема замка Люэра. Закройте узел, и стабилизируйте трубку в правильном положении. Затем разрежьте полую вену, чтобы кровь вышла.
Печень должна быстро начать набухать и отбеливаться уже через две-три секунды. Это подтверждает, что перфузионный буфер протекает через печень. Медленно увеличивайте скорость насоса до 10 миллилитров в минуту и выдерживайте не менее 10 минут, чтобы обеспечить очистку печени от крови.
Во время перфузии придавите тампоном к полой вене с интервалом в 10 секунд. Печень должна набухать во время зажима и расслабляться при освобождении вены, что приводит к усиленной диссоциации клеток. Периодически повторяйте нажатие.
После перфузии переключите перфузионный раствор на предварительно подогретый раствор для сбраживания, не прерывая поток и не допуская образования пузырьков воздуха в трубке. Увеличьте скорость насоса до 20 миллилитров в минуту, и периодически продолжайте надавливать тампоном для отека печени и расслабления. После переваривания буфер печень должна выглядеть мягкой.
В этот момент иглу можно снять, а насос остановить. Для рассечения печени аккуратно захватите щипцами центральную соединительную ткань, между долями. Перережьте все соединения с другими органами, и приподнимите печень.
Промойте печень, просто погрузив в предварительно охлажденный PBS, плюс 3% раствор стрептококка на несколько секунд. Затем поместите в предварительно охлажденную пробирку William's со средой. Под биологическим колпаком переложите печень в чашку Петри с 15 миллилитрами холодной полной среды Вильяма над подносом, полным льда.
Энергично потревожите ткани скребком, чтобы высвободить клетки в среде. Если переваривание печени выполнено правильно, то выброс должен быть легким. Соберите среду, содержащую клетки, и отфильтруйте ее с помощью фильтра при переносе в стерильную пробирку Falcon.
Вылейте около 15 миллилитров холодной полной среды Вильямса на раздавленную печень в чашке Петри, чтобы помочь освободить больше клеток, и повторите фильтрацию. В конце фазы высвобождения фильтрующий материал должен стать непрозрачным после освобождения печеночных клеток. Оставшаяся печень должна выглядеть волокнистой и должна быть отброшена.
Центрифугируйте отфильтрованную среду, содержащую клетки печени, с низкой скоростью разрыва. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 40 миллилитрах ледяной полной среды Уильяма, затем повторите центрифугирование. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте клеточную палитру в 25 миллилитров ледяной полной среды William's, добавьте в пробирку 25 миллилитров 90% раствора Percoll и аккуратно перемешайте.
У вас должна получиться видимая палитра на дне пробирки, соответствующая жизнеспособным гепатоцитам, а слой на вершине градиента состоит из мертвых гепатоцитов. Отсасывайте слой мертвых клеток от верха градиента и оставьте один, два миллилитра среды с гранулой. Ресуспендируйте гранулу в 30, 40 миллилитрах среды.
Центрифугируйте при 200г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, затем аспирируйте надосадочную жидкость. Добавьте необходимое количество среды для подсчета. Подсчитайте жизнеспособность клеток с помощью от одного до 10 трипанового синего.
Для 2D-культуры первичные гепатоциты были покрыты в концентрации 500 000 клеток на лунку из шести многолуночных клеток на покрытых коллагеном клеточных планшетах с предварительно подогретой полной средой Уильяма и помещены в инкубатор. Через три-четыре часа носитель был заменен на новый предварительно нагретый носитель William's Complete. Для 3D культивирования гепатоцитов первичные гепатоциты суспендировали в холодном чистом матриксе Geltrex в концентрации 1000 клеток в 20 микролитрах Geltrex.
Пластину переворачивали вверх дном и оставляли в инкубаторе на 20-30 минут, чтобы матрица затвердела. Затем пластину переворачивали вверх и добавляли специфичную для 3D культуральную среду. Среду меняли каждые два-три дня.
Репрезентативные результаты. В конце процедур настройки мы получили выход клеток от одной до восьми клеток на выделение из печени около 300 граммов крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью трипанового синего, считая после градиента плотности Перколла.
Через четыре часа после осаждения гепатоциты показали кубовидную морфологию. В первый день первичные гепатоциты приобрели свою типичную гексагональную форму, и стали видны липидные капли. На второй-третий день количество липидных капель увеличивается, в то время как на четвертый-пятый день клетки накапливают стрессовые волокна актина.
Резкое снижение жизнеспособности произошло уже в первые дни культивирования, достигнув 49,5% в первые сутки. Этот минимум составляет 33,5% на третий день и достигает 9,1% на пятый день. В нулевой день осаждения печеночных органоидов мы измеряем 30 микрометров.
На второй день культивирования органоиды печени почти удвоили свои размеры, подчеркивая рост размеров, который сохраняется и на пятый день. Форма органоида печени в первый день была круглой, в то время как во второй день они показали форму грозди винограда. На 15-е сутки пролиферативная активность гепатоцитов, зеленых клеток, присутствовала, даже если включение EdU было низким, 9%.
3D-органоиды считаются рубежом персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. По сравнению с двумерными гепатоцитами, органоиды печени все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя более долгосрочный потенциал. Качество передовой 3D-техники требует хорошего выхода жизнеспособных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии и изоляции печени.
Мы уточняем шаги, которые могут показаться более важными при выделении первичных гепатоцитов крыс, и обобщаем разрозненные советы, которые могут легко повлиять на успех метода в модели крыс.
