В этой статье в основном описывается экономически эффективный метод подготовки образцов растений и визуализации с использованием DESI-MSI, и он может преодолеть недостатки, связанные с сухими тканями, которые легко разрушаются при попадании азота. Корень был криосекционирован на микротоме криостата, тогда как лист был подготовлен путем импринтинга, который требует дорогостоящего оборудования или теряет интенсивность сигнала. Наш метод может преодолеть эти ограничения.
Этот метод может быть использован в пространственной метаболомике растений, такой как распределение и перемещение токсикантов в растениях, находящихся в условиях абиотического и биотического стресса. Для начала возьмите очищенные корни и листья двухлетнего растения Salvia miltiorrhiza и нарежьте непосредственно на толщину поперечного сечения примерно от трех до пяти миллиметров. Затем наклейте образец на предметное стекло адгезионного микроскопа с помощью двустороннего скотча.
Поместите еще одно предметное стекло микроскопа над образцом и оберните его герметизирующей пленкой, как бутерброд. Затем заморозьте образец сэндвича при температуре от минус 80 градусов по Цельсию не менее четырех часов, затем подвергните его воздействию воздушного вакуума в течение двух часов с захваченной температурой от минус 75 до минус 82 градусов по Цельсию и вакуумметром от 2,5 до 3,7 паскаля. Для анализа после извлечения образцов из холодильного хранилища доведите их до комнатной температуры в эксикаторе, чтобы избежать конденсации на поверхности образца, прежде чем подвергать образец нанесению на матрицу.
Реализуйте настройку детектора приборов и калибровку массы в режиме ионизации электрораспылением или ESI. Проведите настройку детектора с использованием лейцина и цефалина в ацетонитриле воды в соотношении один к одному и выполните массовую калибровку с формиатом натрия и изопропанолом воды в соотношении один к одному. Выньте источник ESI и установите блок DESI на масс-спектрометр.
Подключите подачу газообразного азота к блоку DESI и отрегулируйте давление газа примерно до 0,5 мегапаскаля. Наполните пятимиллилитровый шприц лейцином, цефалином и муравьиной кислотой в водном метаноле в соотношении один к девяти и присоедините шприц к высокопроизводительному шприцевому насосу, чтобы обеспечить растворитель для ионизации химических веществ в образце. Затем присоедините капилляр, содержащий растворитель, к шприцу и распылителю DESI.
Капилляр, обеспечивающий растворитель, представляет собой стандартный капилляр размеров с внутренним диаметром 75 микрометров и наружным диаметром 375 микрометров. Запустите шприцевой насос и установите скорость настаивания на два микролитра в минуту, чтобы получить постоянный поток и распыление растворителя. Выключите газообразный азотный клапан, а затем включите его примерно через 15 секунд.
Небольшая капля растворителя выдувается на сцену, и можно увидеть, если поток растворителя находится в постоянном состоянии. Затем отрегулируйте положение опрыскивателя с точки зрения угла распыления, оси XYZ, выступа и высоты. Используйте красные и черные маркеры в качестве эталонов для оптимизации сигнала масс-спектрометрии, чтобы получить интенсивность сигнала примерно от 10 до пятой в режиме чувствительности.
Поскольку выступ опрыскивателя является наиболее существенным фактором, влияющим на интенсивность сигнала, отрегулируйте выступ, изменив защиту газообразного азота с помощью пятимиллиметрового ключа. Направление распыления влияет на качество изображения массы. Следовательно, вращайте опрыскиватель до тех пор, пока распыление не станет прямым.
После всех этих шагов установка готова к экспериментам и, как правило, стабильна в течение примерно трех недель после первоначальной настройки. Для визуализации DESI-MS предварительная обработка образца не требуется. Тем не менее, удалите лишние носители на слайдах, если это возможно.
Сфотографируйте образец на слайде. Не касаясь поверхности образца, чтобы избежать попадания примесей, поместите предметное стекло в положение пластины на ступени DESI, которая имеет два положения пластины, A и B. Используйте стандартные предметные стекла или полный слайд, чтобы соответствовать положению. Полный слайд может вместить до четырех слайдов и, таким образом, имеет гораздо большую площадь для экспериментов.
Откройте программное обеспечение для массовой обработки изображений высокой четкости. Установите новую пластину на вкладке «Приобретение» и выберите правильное положение пластины, A или B, а также тип пластины. На странице «Выбор изображения» выделите четыре угла слайда, после чего изображение будет автоматически настроено на правильную ориентацию.
Чтобы задать параметры MS, выберите тип эксперимента как режим DESI-MS, который обычно используется, в котором будет обнаружен только родительский ион. Затем выберите полярность как положительную или отрицательную, так как прибор может использовать только одну полярность в эксперименте. Затем примените режим чувствительности, чтобы получить больше информации о химических веществах в небольших количествах.
Затем нарисуйте прямоугольник, чтобы определить область сканирования на вкладке «Узор», и установите размер пикселя, оставив размеры пикселей по осям X и Y равными. Установите скорость сканирования не более чем в пять раз больше пикселя. Сохраните проект и экспортируйте рабочий лист для программного обеспечения MS Acquisition.
Затем импортируйте рабочий лист в программное обеспечение для сбора данных MS и сохраните его как новый список образцов. Нажмите «Начать выполнение», чтобы начать сканирование изображений MS, и несколько изображений можно добавить в очередь эксперимента, импортировав больше листов. Загрузите файл данных образца в программное обеспечение для массовой обработки изображений и установите параметры для обработки изображений DESI.
Поскольку лейцин и цефалин использовались для массы внутреннего замка, а масса замка является единственной точкой для определения полярности эксперимента, крайне важно установить правильную массу замка. Установите 556.2772 для положительного режима и 554.2620 для отрицательного режима. Чтобы построить список целевых химических веществ, загрузите обработанный файл данных, чтобы визуализировать изображение образца DESI.
Нажмите кнопку «Нормализация», чтобы нормализовать данные с помощью общей ионной хроматографии, чтобы получить относительную интенсивность конкретного химического вещества к эталону, а затем различные образцы могут быть сравнены друг с другом. Нарисуйте интересующую область или ROI и скопируйте несколько копий на образец изображения. Затем выберите все ROI и экспортируйте многомерный анализ, чтобы извлечь информацию MS из всех ROI.
Масс-спектрометрическая визуализация корневых и целых срезов листьев показывает пространственное распределение выбранных соединений. Цвет каждого отдельного пикселя представляет собой относительную интенсивность отношения массы к заряду и, таким образом, может быть связан с естественным распределением и содержанием метаболит-иона по всему образцу. Распределение целевых соединений, таншинона IIA и розмариновой кислоты, видно в разных областях корня.
Соединение таншинол А было обнаружено в срезах листьев В качестве протокола, направленного на воспроизводимость, наиболее важным является оптимизация интенсивности сигнала путем регулировки положения опрыскивателя в нескольких измерениях.
