使用DESI-MSI鉴定中药空间代谢组中代谢物的可视化

本文主要介绍了一种使用DESI-MSI制备植物样品和成像的经济高效的方法，可以克服干燥组织在氮气吹入时容易断裂的缺点。根在低温恒温器切片机上冷冻切片，而叶子是通过印记制备的，这需要昂贵的机器或失去信号强度。我们的方法可以克服这些限制。

该方法可用于植物的空间代谢组学，例如非生物和生物胁迫下植物中有毒物质的分布和运动。首先，从一株两年生的丹参植物中取出干净的根和叶，直接以大约三到五毫米的横截面厚度切片。然后，使用双面胶带将样品粘附在粘附显微镜载玻片上。

将另一个显微镜载玻片放在样品上方，并用像三明治一样的密封膜包裹它们。接下来，将夹心样品在零下 80 摄氏度下冷冻至少四个小时，然后将其置于空气真空下两个小时，滞留温度为零下 75 至 -82 摄氏度，真空计为 2.5 至 3.7 帕斯卡。为了进行分析，从冷藏库中取出样品后，在干燥器中将它们带到室温，以避免样品表面冷凝，然后再对样品进行基质应用。

在电喷雾电离或ESI模式下实施仪器检测器设置和质量校准。使用亮氨酸和头孢林在水乙腈中以1比1的比例进行检测器设置，并用甲酸钠和水异丙醇以1比1的比例进行质量校准。取出ESI源并将DESI单元安装到质谱仪上。

将氮气供应连接到DESI装置，并将气体压力调节到0.5兆帕左右。在甲醇水中以 1 比 9 的比例将亮氨酸、头孢林和甲酸填充 5 毫升注射器，并将注射器连接到高性能注射泵上，为样品中化学物质的电离提供溶剂。接下来，将提供溶剂的毛细管连接到注射器和DESI喷雾器上。

提供毛细管的溶剂是尺寸为75微米和外径为375微米的标准毛细管。启动注射泵并将注入速率设置为每分钟两微升，以获得恒定的流量和溶剂喷雾。关闭氮气阀，然后在大约 15 秒后打开它。

一小滴溶剂吹到载物台上，如果溶剂流动处于恒定状态，则可以看到喷雾。接下来，根据喷雾角度、XYZ 轴、突起和高度调整喷雾器的位置。使用红色和黑色标记作为参考来优化质谱信号，在灵敏度模式下获得大约 1 倍 10 到 5 倍的信号强度。

由于喷雾器的突出部分是影响信号强度的最重要因素，因此请使用 5 毫米扳手更换氮气防护装置来调整突起。喷涂方向会影响质量图像的质量。因此，旋转喷雾器直到喷雾笔直。

完成所有这些步骤后，设置即可进行实验，并且在初始设置后通常稳定约三周的可用性。对于DESI-MS成像，不需要样品预处理。但是，如果可能，请清除载玻片上多余的介质。

在载玻片上拍摄样品的图像。在不接触样品表面以避免任何杂质的情况下，将载玻片放在DESI载物台上的板位置，该载物台有两个板位置，A和B.使用标准载玻片或全载玻片以适应该位置。一张完整的载玻片最多可容纳四张载玻片，因此实验面积要大得多。

打开高清海量图像处理软件。在"采集"选项卡中设置新印版，然后选择正确的印版位置、A 或 B 以及印版类型。在"图像选择"页上，选择幻灯片的四个角，然后将图像自动调整为正确的方向。

要设置MS参数，请选择通常使用的DESI-MS模式，其中仅检测母离子。接下来，选择极性为正极或负极，因为仪器在实验中只能使用一个极性。然后应用灵敏度模式以获取有关少量化学品的更多信息。

接下来，绘制一个矩形以定义"图案"选项卡中的扫描区域，并通过保持像素的 X 和 Y 大小相等来设置像素大小。将扫描速率设置为不超过像素大小的五倍。保存项目并导出 MS 采集软件的工作表。

接下来，将工作表导入MS采集软件并将其另存为新的样品列表。按"开始运行"开始MS图像扫描，可以通过导入更多工作表将多个图像添加到实验队列中。将样品的数据文件加载到海量图像处理软件中，并设置DESI图像处理的参数。

由于亮氨酸和头孢林用于内部锁定质量，并且锁定质量是识别实验极性的唯一点，因此设置正确的锁定质量至关重要。将 556.2772 设置为正模式，将 554.2620 设置为负模式。要构建目标化学品列表，请加载处理后的数据文件以可视化样品的 DESI 图像。

点击归一化按钮，通过全离子色谱对数据进行归一化，得到特定化学物质与参比的相对强度，然后可以将不同的样品相互比较。绘制感兴趣区域或 ROI，并在示例图像上复制多个副本。然后选择所有ROI并导出多变量分析，以从所有ROI中提取MS信息。

根部和整个叶段的质谱成像显示了所选化合物的空间分布。每个像素的颜色代表质荷比的相对强度，因此可以与整个样品中代谢物离子的自然分布和丰度相关联。目标化合物丹参酮IIA和迷迭香酸的分布在根的不同区域可见。

在叶片中检测到化合物丹精醇A 作为旨在再现性的协议，最重要的是通过在多个维度上调整喷雾器的位置来优化信号强度。