Наш протокол представляет собой быструю и высокочувствительную систему обнаружения вируса лягушки 3. Важно отметить, что этот метод позволяет обнаруживать ДНК-вирусы на месте оказания медицинской помощи, играя решающую роль в предотвращении возникновения пандемических заболеваний. Основное преимущество этого метода заключается в интеграции RPA с системой CRISPR/Cas12a, дополненной портативным микроскопом на основе смартфона и классификацией ИИ.
Такая интеграция значительно повышает эффективность и точность обнаружения при одновременном снижении количества ошибок, связанных с человеческим фактором. Для начала добавьте четыре ключевых фермента RPA в реакционный буфер. Затем добавьте в смесь заранее разработанные грунтовки.
Тщательно перемешайте смесь. Добавьте один микролитр целевой ДНК, полученной из вируса лягушки 3, в каждую реакцию RPA и хорошо перемешайте. Затем пипеткой нанесите семь микролитров 100 миллимолярного хлорида магния, чтобы начать реакцию.
Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы завершить анализ. Подготовьте белок бактерии Lachnospiraceae CAS12a с CRISPR RNA для образования функциональных комплексов. Смешайте бактериальный белок и 10 реакционных буферов CRISPR/Cas12a.
Теперь добавьте 500 наномолярных одноцепочечных репортерных зондов ДНК. Добавьте один микролитр продукта реакции RPA в реакционную смесь CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Измерьте флуоресцентные сигналы с помощью считывателя микропланшетов. Для детектирования с помощью микроскопа смартфона сначала пипеткой нанесите приготовленную реакционную смесь на отступившее предметное стекло. Затем накройте его покровным стеклом перед инкубацией.
Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа смартфона и отрегулируйте фокусное расстояние и четкость. Захват изображения для измерения флуоресцентных сигналов. Используйте ImageJ для измерения среднего значения серого для каждого изображения и стандартного отклонения среднего значения серого для группы концентраций.
Примите модель глубокого обучения AlexNet 33 для классификации. Теперь используйте Python, чтобы изменить форму входных изображений до 224 на 224 по трем каналам. Наконец, используйте предварительно обученную магистральную сеть с набором данных ImageNet для извлечения объектов изображения.
Шестая пара капсюлей обеспечивала максимальную эффективность усиления и была выбрана. CRISPR RNA-3 оказался наиболее эффективным для коллатерального расщепления. Использование разработанной системы детектирования с выбранными праймерами RPA и CRISPR RNA привело к значимым различиям между 10 aM FV3 и контролем.
Наиболее важным моментом, о котором следует помнить, является конкретный шаг обнаружения CAS 12a. CRISPR РНК реакции может быть модифицирована или перепроектирована для нацеливания на другие ДНК-вирусы на основе обнаружения CAS 12a. Предложенный метод может помочь в предварительной оценке количества целевого вируса.
Исходя из этого, для получения более точной вирусной нагрузки можно использовать другие методы, такие как количественная ПЦР. Этот метод обеспечивает предварительную попытку портативного обнаружения ДНК-вирусов. Что касается вируса лягушки 3, используемого в этом протоколе, своевременное обнаружение может подтолкнуть к эффективным защитным мерам, снижающим потери в племенной отрасли.
