Трансгенные рыбки данио-рерио оказались критически важными для нашего понимания развития эмбриона. Система Tol2 является универсальным инструментом, который позволяет исследователям быстро и систематически генерировать несколько трансгенных рыбок данио-рерио для исследований FASD. Модульная конструкция и простота создания новых компонентов набора делают систему Tol2 универсальным инструментом для создания новых трансгенных препаратов без необходимости переделывать какие-либо компоненты набора.
Мой совет исследователям, впервые применяющим эту технику, состоит в том, чтобы сделать несколько пробных запусков, чтобы потренироваться на точности создания и введения трансгенных конструкций. Для начала линеаризуют плазмиду набора Tol2, содержащую транспозазу, с нулевой эндонуклеазой рестрикции, объединив 10 микролитров плазмиды транспозазы, 1,5 микролитра рестрикционного реакционного буфера эндонуклеазы и 0,3 микролитра нуклеазы одной эндонуклеазы в микроцентрифужной пробирке объемом 500 микролитров. Залейте реакцию до 20 микролитров водой, не содержащей РНК.
Смешайте и переварите при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день остановите пищеварение, добавив в реакционную смесь один микролитр 0,5 моляра ЭДТА, два микролитра пятимолярного ацетата аммония и 80 микролитров 100% этанола. Смешайте и охладите при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение ночи.
На следующий день центрифугируют и аспирируют надосадочную жидкость перед ресуспендированием гранулы ДНК в воде, не содержащей РНК. Затем определите линейную концентрацию плазмиды в нанограммах на микролитр на флуорометре, запустив два микролитра образца. Настройте производство мРНК SP6, объединив 10 микролитров 2X NTP / CAP, два микролитра 10X реакционного буфера, от 0,1 до одного микрограмма линейной матрицы ДНК в двух микролитрах смеси ферментов SP6 в пробирке объемом 500 микролитров.
Заполните реакцию до 20 микролитров водой, не содержащей РНК, и перемешайте перед инкубацией при 37 градусах Цельсия. Через два часа добавьте один микролитр ДНКазы, хорошо перемешайте и инкубируйте еще 15 минут. Остановите реакцию, добавив 30 микролитров осаждающего раствора хлорида лития.
Смешайте и охладите при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение ночи. На следующий день центрифугируйте раствор для гранулирования мРНК и аспирации надосадочной жидкости перед промывкой гранулы одним миллилитром 80% этанола. Высушите гранулы на воздухе и ресуспендируйте их в 20 микролитрах воды, не содержащей РНК.
Определите концентрацию мРНК с помощью флуорометра, затем аликвотируйте 100 нанограммов мРНК на пробирку для одноразового использования и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы выполнить реакцию, соберите по 10 фемтомол P5E, PME и P3E и 20 фемтомол целевого вектора PDEST. Определите размер всех четырех векторов и пар оснований из источника плазмиды.
После определения концентрации всех четырех векторов, используя вес ДНК как 660 граммов на моль, а также размер плазмиды и пары оснований, рассчитайте общее количество нанограммов плазмиды, необходимое для достижения либо 10 фемтомол для векторов входа, либо 20 фемтомол для вектора назначения. Затем сгенерируйте конструкцию sox17:EGFP-CAAX, используя компоненты, описанные в рукописи. Используя концентрацию плазмиды, рассчитайте общее количество микролитров каждой плазмиды, необходимое для достижения 10 фемтомол или 20 фемтомолей, а затем разделите это на два для использования в пяти микролитрах реакциях половины LR.
Сгенерируйте 10 фемтомол P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly (A) и 20 фемтомол целевого вектора. Настройте реакцию половины LR объемом пять микролитров, объединив объемы P5E, PME, P3E и PDEST в пробирке объемом 500 микролитров. Затем добавьте стерильную воду, чтобы получился объем четыре микролитра.
Перемешайте фермент LR дважды в течение одной минуты каждый, прежде чем добавить один микролитр в реакцию, и тщательно перемешайте перед инкубацией при 25 градусах Цельсия. На следующий день остановите реакцию LR, добавив 0,5 микролитра протеиназы K. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем охладите до комнатной температуры. Затем превратите три-четыре микролитра плазмиды в размороженные химически компетентные клетки, добавив плазмиду и оставив клетки на льду в течение 25-30 минут.
Затем термический шок клеток на водяной бане с температурой 42 градуса Цельсия в течение 30 секунд. После теплового шока добавьте в клетки 250 микролитров жидкой среды, не содержащей антибиотиков, и инкубируйте при встряхивании при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов. Нанесите 300 микролитров бактериальной суспензии на одну пластину ампициллина Лурия-Бертани и инкубируйте в течение ночи.
На следующий день проведите скрининг колоний на наличие двух фенотипов: прозрачного и непрозрачного. Собирайте прозрачные колонии по одной, инокулируйте жидкую культуру и встряхивайте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи. Объедините 150 нанограммов плазмиды, 100 нанограммов мРНК транспозазы и 2% фенольного красного на льду.
Затем добавьте воду без РНК, чтобы объем составил три микролитра. Перенесите эмбрион на одной клеточной стадии с помощью пипеток для переноса на инъекционную пластину, заполненную ЭМ, полностью покрывающую агар, а затем осторожно прижмите примерно от 50 до 75 эмбрионов в прорезь инъекционной пластины. Добавьте красную смесь мРНК-плазмиды фенола к открытому концу иглы для капиллярной инъекции.
Поместите капиллярную иглу в якорь инжекционной установки и включите инжекционную установку. Опустите иглу в инъекционную пластину и сломайте наконечник с помощью щипцов, чтобы откачать только небольшое количество смеси инжекционной установкой. Вводят эмбрионам трехнанолитровый болюс смеси фенол плазмиды мРНК в тело клетки эмбриона.
Когда закончите, удалите эмбрионы из инъекционной пластины, осторожно вытащив их из прорези, и перенесите их пипеткой в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим ЭМ. Инкубировать при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Выберите подходящую стадию развития для экспрессии флуоресцентного трансгена и проведите скрининг под флуоресцентным препарирующим микроскопом. Скрининг нефлуоресцентных трансгенов путем скрининга флуоресцентных трансгенных маркеров, таких как GFP, управляемых кардиоспецифическим промотором гена Cmlc2.
Когда эмбрионы, положительные для трансгенной вставки, развиваются во взрослых особей и достигают возраста размножения, проведите их индивидуальный скрининг на передачу зародышевой линии и экспрессивность трансгенов, скрещивая их с рыбками данио-рерио дикого типа. Показаны примеры бактериальных колоний, полученных в результате трансформации рекомбинации LR. Прозрачные колонии содержали правильный продукт рекомбинации LR более чем в 85% случаев, тогда как непрозрачные колонии никогда не содержали правильного продукта рекомбинации.
Диагностическое переваривание трех колоний в результате трансформации продуктов рекомбинации LR показало, что одна непрозрачная колония не содержала плазмиды, в то время как две прозрачные колонии содержали одну полосу в 9 544 пары оснований. Здесь показана транспозазная мРНК на 1 950 пар оснований. Мозаичная экспрессия энтодермы EGFP-CAAX наблюдалась у 75% инъецированных эмбрионов.
Экспрессия трансгенных маркеров Cmlc2 EGFP в развивающемся сердце наблюдалась через 24 часа после оплодотворения. Взрослые рыбки данио-рерио имели зародышевую передачу флуоресцентных эмбрионов, сгенерированных sox17: EGFP-CAAX, с энтодермой, полностью меченной EGFP-CAAX. Как передне-задняя длина энтодермы, так и дорсально-вентральная длина каждого мешочка от первого до пятого мешочка были измерены у контрольных и обработанных этанолом эмбрионов BMP дикого типа.
Общая длина энтодермы не зависела от генотипа или лечения. Тем не менее, первый и третий мешочки показали значительное увеличение длины мешочка между необработанными и обработанными этанолом эмбрионами дикого типа, но значительное уменьшение длины между необработанными и обработанными этанолом мутантами BMP. Второй мешочек показал значительное увеличение размера мешочка между необработанным и обработанным этанолом диким типом и мутантными группами BMP соответственно.
При попытке этой процедуры очень важно быть точным при пипетке и разбавлении системы Tol2, а также при попадании в тело клетки во время инъекции эмбриона.
