I pesci zebra transgenici si sono dimostrati fondamentali per la nostra comprensione dello sviluppo embrionale. Il sistema Tol2 è uno strumento versatile che consente ai ricercatori di generare rapidamente e sistematicamente più pesci zebra transgenici per gli studi FASD. Il design modulare e la facilità di generazione di nuovi componenti del kit rendono il sistema Tol2 uno strumento versatile per generare nuovi transgenici senza dover riprogettare alcun componente del kit.
Il mio consiglio ai ricercatori che eseguono questa tecnica per la prima volta è di fare diverse prove per allenarsi sulla precisione della generazione e dell'iniezione di costrutti transgenici. Per iniziare, linearizzare il plasmide del kit Tol2 contenente transposasi con un'endonucleasi di restrizione nought one combinando 10 microlitri di plasmide di trasposasi, 1,5 microlitri di tampone di reazione endonucleasi di restrizione e 0,3 microlitri di nought un'endonucleasi in una provetta da microcentrifuga da 500 microlitri. Riempire la reazione fino a 20 microlitri con acqua priva di RNAsi.
Mescolare e digerire a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, interrompere la digestione aggiungendo un microlitro di 0,5 molari EDTA, due microlitri di acetato di ammonio a cinque molari e 80 microlitri di etanolo al 100% alla miscela di reazione. Mescolare e raffreddare a meno 20 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno seguente, centrifugare e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet di DNA in acqua priva di RNAsi. Quindi determinare la concentrazione lineare del plasmide in nanogrammi per microlitro su un fluorometro eseguendo due microlitri del campione. Impostare la produzione di mRNA SP6 combinando 10 microlitri di 2X NTP / CAP, due microlitri di tampone di reazione 10X, da 0,1 a un microgrammo di modello di DNA lineare in due microlitri di miscela enzimatica SP6 in un tubo da 500 microlitri.
Riempire la reazione fino a 20 microlitri con acqua priva di RNAsi e mescolare prima di incubare a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, aggiungere un microlitro di DNAse, mescolare bene e incubare per altri 15 minuti. Interrompere la reazione aggiungendo 30 microlitri di soluzione di precipitazione di cloruro di litio.
Mescolare e raffreddare a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, centrifugare la soluzione per pellettare l'mRNA e aspirare il surnatante prima di lavare il pellet con un millilitro di etanolo all'80%. Asciugare all'aria il pellet e risospenderlo in 20 microlitri di acqua priva di RNAsi.
Determinare la concentrazione di mRNA utilizzando un fluorometro, quindi aliquote 100 nanogrammi di mRNA per provetta per uso singolo e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per eseguire la reazione, raccogliere 10 femtomolo ciascuno di P5E, PME e P3E e 20 femtomole del vettore di destinazione PDEST. Identificare la dimensione di tutti e quattro i vettori e le coppie di basi dalla sorgente plasmidica.
Dopo aver determinato la concentrazione di tutti e quattro i vettori, utilizzando il peso del DNA come 660 grammi per mole e le dimensioni del plasmide e le coppie di basi, calcolare i nanogrammi totali di plasmide necessari per raggiungere 10 femtomole per i vettori di ingresso o 20 femtomole per il vettore di destinazione. Quindi, generare il costrutto sox17:EGFP-CAAX utilizzando i componenti descritti nel manoscritto. Utilizzando la concentrazione di plasmidi, calcolare i microlitri totali di ciascun plasmide necessari per raggiungere 10 femtomole o 20 femtomolo, quindi dividerlo per due per l'uso nelle reazioni di mezzo LR da cinque microlitri.
Genera 10 femtomole di P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) e 20 femtomole del vettore di destinazione. Impostare cinque microlitri di mezza reazione LR combinando i volumi di P5E, PME, P3E e PDEST in un tubo da 500 microlitri. Quindi aggiungere acqua sterile per rendere il volume di quattro microlitri.
Vortice l'enzima LR mescolare due volte per un minuto ciascuno prima di aggiungere un microlitro alla reazione e mescolare accuratamente prima di incubare a 25 gradi Celsius. Il giorno seguente, interrompere la reazione LR aggiungendo 0,5 microlitri di proteinasi K.Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, trasformare da tre a quattro microlitri di plasmide in cellule chimicamente competenti scongelate aggiungendo il plasmide e lasciando riposare le cellule sul ghiaccio per 25-30 minuti.
Quindi riscaldare le celle in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Dopo lo shock termico, aggiungere 250 microlitri di mezzi liquidi ricchi di antibiotici alle cellule e incubare agitando a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Stendere 300 microlitri di sospensione batterica su una piastra di ampicillina Luria-Bertani e incubare durante la notte.
Il giorno seguente, esaminare le colonie per la presenza di due fenotipi: chiaro e opaco. Scegli le colonie chiare una alla volta, inocula la coltura liquida e agita a 37 gradi Celsius durante la notte. Combinare 150 nanogrammi di plasmide, 100 nanogrammi di mRNA trasposasi e 2% di rosso fenolo su ghiaccio.
Quindi aggiungere acqua priva di RNA per rendere il volume di tre microlitri. Trasferire un embrione allo stadio cellulare utilizzando pipette di trasferimento sulla piastra di iniezione riempita con EM che copre completamente l'agar e quindi premere delicatamente circa 50-75 embrioni per slot della piastra di iniezione. Aggiungere la miscela rosso plasmide fenolo mRNA all'estremità aperta di un ago per iniezione capillare.
Posizionare l'ago capillare nell'armatura del carro di iniezione e accendere il carro di iniezione. Abbassare l'ago nella piastra di iniezione e rompere la punta usando una pinza per consentire solo una piccola quantità di miscela di essere pompata dal carro di iniezione. Iniettare gli embrioni con un bolo da tre nanolitri della miscela rosso plasmide fenolo mRNA nel corpo cellulare dell'embrione.
Al termine, rimuovere gli embrioni dalla piastra di iniezione estraendoli delicatamente dalla fessura e trasferirli pipettandoli in una capsula di Petri da 100 millimetri con EM fresco. Incubare a 28,5 gradi Celsius. Scegliere lo stadio di sviluppo appropriato per l'espressione del transgene fluorescente e lo screening al microscopio da dissezione fluorescente. Screening per transgeni non fluorescenti mediante screening per marcatori transgenici fluorescenti come GFP guidati dal promotore cardiaco-specifico per il gene Cmlc2.
Quando gli embrioni positivi all'inserimento transgenico si sviluppano in adulti e raggiungono l'età riproduttiva, selezionarli individualmente per la trasmissione germinale e l'espressività transgenica allevandoli al pesce zebra selvatico. Vengono mostrate colonie batteriche di esempio ottenute dalla trasformazione della ricombinazione LR. Le colonie chiare contenevano un prodotto di ricombinazione LR corretto più dell'85% delle volte, mentre le colonie opache non contenevano mai un prodotto di ricombinazione corretto.
La digestione diagnostica delle tre colonie dalla trasformazione dei prodotti di ricombinazione LR ha mostrato che la singola colonia opaca non conteneva alcun plasmide, mentre le due colonie chiare contenevano una singola banda a 9.544 coppie di basi. L'mRNA della trasposasi a 1.950 coppie di basi è mostrato qui. L'espressione dell'endoderma a mosaico EGFP-CAAX è stata osservata nel 75% degli embrioni iniettati.
L'espressione transgenica del marcatore Cmlc2 EGFP nel cuore in via di sviluppo è stata osservata 24 ore dopo la fecondazione. Il pesce zebra adulto aveva una trasmissione germinale di sox17: EGFP-CAAX ha generato embrioni fluorescenti con l'endoderma completamente etichettato con EGFP-CAAX. Sia la lunghezza antero-posteriore dell'endoderma che la lunghezza dorsale-ventrale di ciascuna sacca da una a cinque sono state misurate in embrioni mutanti BMP di tipo selvatico trattati con etanolo e di controllo.
La lunghezza complessiva dell'endoderma non è stata influenzata dal genotipo o dal trattamento. Tuttavia, le buste uno e tre hanno mostrato aumenti significativi della lunghezza della sacca tra embrioni wild type non trattati e trattati con etanolo, ma diminuzioni significative della lunghezza tra mutanti BMP non trattati e trattati con etanolo. La sacca due ha mostrato aumenti significativi delle dimensioni della busta tra i gruppi wild type e mutanti BMP non trattati e trattati con etanolo rispettivamente.
Quando si tenta questa procedura, è fondamentale essere precisi nel pipettaggio e nella diluizione del sistema Tol2, oltre a colpire il corpo cellulare durante l'iniezione dell'embrione.
