Этот протокол необходим для оценки различных ролей определенных биохимических элементов в ядре и цитоплазме и для анализа внутриклеточных взаимодействий между этими доменами в различных клеточных линиях. Этот метод использует обычное лабораторное оборудование и реагенты для более эффективного разделения цитоплазматической и ядерной фракций. Этот протокол может сделать это дешевле и быстрее, чем другие протоколы.
По мере того, как исследования цитоплазматических и ядерных взаимодействий становятся все более распространенными, влияние локализации на внутриклеточные события может стать более понятным. Обмен между цитоплазмой и ядром может быть проанализирован, что указывает на то, могут ли определенные молекулы во время этих обменов привести к развитию рака, как показали исследования ядерных белков. Наиболее важным шагом в протоколе является изменение концентрации буфера лизиса до надлежащей концентрации.
Поскольку использование лизисного буфера во многом зависит от разрушения клеточных мембран, существуют естественные варианты эффективности лизисного буфера на разных клеточных линиях. Для начала гранулируйте клетки, используя 1,5-миллилитровые пробирки с помощью центрифугирования в течение пяти минут при 2000 г. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки. Ресуспендируйте гранулу в 300 микролитрах ледяного буфера для лизиса.
Затем вращайте трубки со скоростью около 12 000 G при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Аккуратно извлеките надосадочную жидкость и поместите ее в новую 1,5-миллилитровую пробирку. Оставшаяся гранула будет ядерной фракцией.
Затем добавьте 500 микролитров ледяного PBS в гранулы и центрифугу при 2000 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Чтобы подтвердить разделение компартментов с помощью кПЦР, сначала преобразуйте РНК в комплементарную ДНК с помощью коммерчески доступного набора. Приготовьте мастер-микс с обратной транскриптазой.
Добавьте матричную РНК. Инкубируйте реакции в термоциклере. Приступайте к выполнению количественной полимеразной цепной реакции и анализа.
Начните с разбавления синтеза кДНК водой DEPC, чтобы получить конечную концентрацию 20 нанограммов на миллилитр. Используя мастер-смесь для ПЦР, подготовьте реакцию для каждого образца, используя ручные инструкции. Приобретите коммерческие зонды, необходимые для обнаружения цитоплазматического и ядерного фракционирования.
Используйте MALAT1 в качестве ядерного маркера и TUG1 в качестве цитоплазматического маркера. Рассчитайте объем каждого компонента, умножив каждый компонент на три для каждой из технических реплик для отдельного образца. Для каждого ядерного и цитоплазматического образца приобретите ядерную фракцию смесей с MALAT1, цитоплазматическую фракцию с MALAT1, ядерную фракцию с TUG1 и цитоплазматическую фракцию с TUG1.
Кратковременно перемешайте растворы и перенесите 20 микролитров смеси в каждую лунку оптической реакционной пластины. Накройте пластину прозрачной клейкой пленкой, используемой для кПЦР, и ненадолго центрифугируйте пластину, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем открутите образец при 300 перегрузках в течение пяти минут при комнатной температуре. Используя программное обеспечение для проектирования и анализа, выберите стандартную кривую для параметров езды на велосипеде.
Используя программное обеспечение qPCR, выберите Запуск установки. На странице свойств файла данных выберите параметры метода и цикла ввода. После ввода параметров цикла выберите вкладку пластины и введите образцы для запуска.
Выберите запустить запуск. После завершения выполнения создайте электронную таблицу данных с именем примера, целевым именем и циклом количественной оценки. Начните с образцов MALAT1, чтобы рассчитать ядерную фракцию.
Вычтите цитоплазматическую фракцию MALAT1 из ядерной фракции MALAT1. Продолжите работу с образцами MALAT1, чтобы рассчитать цитоплазматическую фракцию. Вычтите ядерную фракцию MALAT1 из цитоплазматической фракции MALAT1, а затем рассчитайте две увеличенные до отрицательного дельта-CQ. Выполните расчеты с образцами TUG1.
Когда TUG1 присутствует в качестве положительного контроля для цитоплазматических элементов, ожидается, что уровни цитоплазматического фракционирования будут выше, чем уровни ядерного фракционирования. Отрицательный результат, когда уровни цитоплазматического фракционирования наблюдаются в образце с MALAT1. Это указывает на загрязнение РНК, выделенной из ядерной фракции, возможно, из-за слишком низких или слишком высоких концентраций лизиса.
MALAT1 и TUG1 показали самую высокую корреляцию с ядерным и цитоплазматическим разделением, что было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга и электрофореза РНК, который подтвердил чистоту и качество образцов. Кроме того, чистота ядерных и цитоплазматических экстрактов может быть продемонстрирована вестерн-блоттингом с использованием ламина в качестве маркера ядерной фракции и альфа-тубулина в качестве положительного маркера цитоплазматической фракции. При электрофорезе цитоплазматической РНК пика не наблюдалось, что свидетельствует о высоком качестве и незначительном загрязнении или отсутствии загрязнения в образце цитоплазматической РНК.
Использование буфера лизиса имеет решающее значение для правильного фракционирования, и оптимизация концентрации буфера лизиса до желаемой интересующей клеточной линии имеет важное значение. Этот метод позволяет целенаправленно изучать ядерное и цитоплазматическое взаимодействие, что широко применимо к различным темам исследований и позволяет лучше понять, как локализация конкретных биологических элементов может коррелировать с их функцией.
