Ce protocole est nécessaire pour évaluer les différents rôles d’éléments biochimiques définis dans le noyau et le cytoplasme et pour analyser les interactions intracellulaires entre ces domaines au sein de diverses lignées cellulaires. Cette technique utilise des équipements de laboratoire et des réactifs courants pour séparer plus efficacement les fractions cytoplasmique et nucléaire. Ce protocole peut le faire moins cher et plus rapidement que les autres protocoles.
À mesure que les études sur les interactions cytoplasmiques et nucléaires se généralisent, l’impact de la localisation sur les événements intracellulaires peut être mieux compris. L’échange entre le cytoplasme et le noyau peut être analysé, indiquant si certaines molécules au cours de ces échanges peuvent conduire au développement du cancer, comme l’ont indiqué des études sur les protéines nucléaires. L’étape la plus critique du protocole consiste à modifier la concentration du tampon de lyse à une concentration appropriée.
Comme l’utilisation du tampon de lyse dépend en grande partie de la perturbation des membranes cellulaires et il existe des variantes naturelles dans l’efficacité du tampon de lyse sur différentes lignées cellulaires. Pour commencer, enduire les cellules en utilisant des tubes de 1,5 millilitre par centrifugation pendant cinq minutes à 2000 G.Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration. Remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon de lyse glacée.
Ensuite, faites tourner les tubes à une vitesse d’environ 12 000 G à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Retirez soigneusement le surnageant et placez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. La pastille restante sera la fraction nucléaire.
Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS glacé à la pastille et centrifugez à 2000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Pour confirmer la séparation des compartiments à l’aide de la qPCR, convertissez d’abord l’ARN en ADN complémentaire à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Préparer le master mix de transcriptase inverse.
Ajouter un ARN modèle. Incuber les réactions dans un thermocycleur. Procéder à l’exécution de la réaction en chaîne et de l’analyse quantitatives de la polymérase.
Commencez par diluer la synthèse de l’ADNc avec de l’eau DEPC pour obtenir une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre. À l’aide d’un mélange maître PCR, préparer la réaction pour chaque échantillon à l’aide d’instructions manuelles. Acquérir les sondes commerciales nécessaires pour détecter le fractionnement cytoplasmique et nucléaire.
Utilisez MALAT1 comme marqueur nucléaire et TUG1 comme marqueur cytoplasmique. Calculer le volume de chaque composant en multipliant chaque composant par trois pour chacune des répliques techniques pour l’échantillon individuel. Pour chaque échantillon nucléaire et cytoplasmique, acquérir la fraction nucléaire des mélanges avec MALAT1, la fraction cytoplasmique avec MALAT1, la fraction nucléaire avec TUG1 et la fraction cytoplasmique avec TUG1.
Vortex brièvement pour mélanger les solutions et transférer 20 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque de réaction optique. Couvrir la plaque avec un film adhésif transparent utilisé pour la qPCR et centrifuger brièvement la plaque pour éliminer les bulles d’air, puis faire tourner l’échantillon à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’un logiciel de conception et d’analyse, sélectionnez la courbe standard pour les paramètres de cyclage.
À l’aide du logiciel qPCR, sélectionnez l’exécution de la configuration. Dans la page des propriétés du fichier de données, sélectionnez les paramètres de méthode et de cycle d’entrée. Après avoir entré les paramètres du cycle, sélectionnez l’onglet de plaque et entrez les échantillons à exécuter.
Sélectionnez Démarrer l’exécution. Une fois l’exécution terminée, créez une feuille de calcul de données avec le nom de l’échantillon, le nom de la cible et le cycle de quantification. Commencez par les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction nucléaire.
Soustrayez la fraction cytoplasmique MALAT1 de la fraction nucléaire MALAT1. Continuez avec les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction cytoplasmique. Soustrayez la fraction nucléaire MALAT1 de la fraction cytoplasmique MALAT1, puis calculez les deux graduées à delta CQ négatif. Effectuez les calculs avec des échantillons TUG1.
Lorsque TUG1 est présent comme témoin positif pour les éléments cytoplasmiques, les niveaux de fractionnement cytoplasmique devraient être plus élevés que les niveaux de fractionnement nucléaire. Un résultat négatif où des niveaux de fractionnement cytoplasmique sont observés dans l’échantillon avec MALAT1. Cela indique une contamination de l’ARN isolé de la fraction nucléaire, potentiellement due à des concentrations de lyse trop faibles ou trop élevées.
MALAT1 et TUG1 présentaient la corrélation la plus élevée avec la séparation nucléaire et cytoplasmique, confirmée par un transfert Western et une électrophorèse de l’ARN, qui a confirmé la pureté et la qualité des échantillons. De plus, la pureté des extraits nucléaires et cytoplasmiques peut être démontrée par un transfert Western utilisant la lamine comme marqueur de la fraction nucléaire et l’alpha-tubuline comme marqueur positif pour la fraction cytoplasmique. Aucun pic n’a été observé dans l’électrophorèse de l’ARN cytoplasmique, démontrant une qualité élevée et peu ou pas de contamination dans l’échantillon d’ARN cytoplasmique.
L’utilisation d’un tampon de lyse est essentielle pour un fractionnement correct et l’optimisation de la concentration du tampon de lyse à la lignée cellulaire d’intérêt souhaitée est essentielle. Cette technique permet l’étude ciblée de l’interaction nucléaire et cytoplasmique, ce qui est largement applicable à une variété de sujets de recherche et permet de mieux comprendre comment la localisation d’éléments biologiques spécifiques peut corréler à leur fonction.
