Этот протокол описывает изготовление микрогелевых стержней, которые соединяются в микропоровые каркасы. Эти каркасы могут быть использованы в сочетании с ячейками, обеспечивающими необходимое пространство для эффективного взаимодействия клеток. Два различных типа микрогелевых стержней соединяются при контакте.
При высоком соотношении сторон приводит к увеличению пор при сохранении стабильности каркаса с использованием меньшего количества синтетического материала по сравнению со сферическими микрогелями. Каркасы микропор значительно усиливают инфильтрацию и взаимодействие эндогенных клеток для восстановления поврежденной ткани. Большие поры будут способствовать образованию кровеносных сосудов для обмена питательными веществами с растущей тканью.
Уменьшение каркасного материала полезно, так как больше открытых пространств предусмотрено для формирования тканей, что важно как для применения in vitro, так и in vivo. Критическим аспектом является микрофитика на технике чипуляции. Чтобы обеспечить непрерывное производство микрогелевых стержней, продукт должен эффективно транспортироваться из трубы без засорения.
Для начала вставьте иглы в полиэтиленовые трубки и удалите газ из шприца и трубки. Затем вставьте дополнительную полиэтиленовую трубку в розетку для сбора продукта. Затем поместите все стеклянные шприцы и шприцевые насосы и вставьте каждый конец трубки в соответствующее входное отверстие.
Затем наведите микроскоп на поперечное сечение масляной воды. Запустите первый масляный шприцевой насос, чтобы сначала заполнить канал маслом, чтобы предотвратить смачивание канала дисперсной фазой. Затем уменьшите скорость первого потока масла до 30 микролитров в час и запустите насос для предварительного полимерного шприца до тех пор, пока дисперсная водная фаза не будет наблюдаться на поперечном сечении.
Затем установите скорость потока предварительного полимера на 30 микролитров в час и сфокусируйте микроскоп на выходе. Затем запустите второй масляный шприцевой насос и подождите, пока режим потока стабилизируется. Поместите выходную трубку в контейнер для сбора и установите систему ультрафиолетового облучения таким образом, чтобы интенсивность излучения находилась в диапазоне от 900 до 1000 милливатт на квадратный сантиметр.
А место облучения – это прямая канальная часть перед выходом. Перед УФ-облучением отрегулируйте скорость потока предварительного полимера и первого масла для достижения желаемого соотношения сторон в диапазоне от 3,0 до 4,5 и установите время облучения дисперсной фазы примерно на 2,3 секунды, в зависимости от размера точки облучения. Затем начинайте УФ-облучение, а при необходимости снова отрегулируйте скорость потока согласно предыдущему подразделу.
Затем измените контейнер сбора и запишите время начала сбора продукта и скорость потока. Чтобы завершить сбор, удалите контейнер коллекции, отметив время. После этого прекратите облучение и все шприцевые насосы.
Затем промыть продукт по пять раз н-гексаном, изопропанолом и деионизированной водой. Затем удаляют супернатант после стержневого осаждения. Перенесите дисперсию первого компонента в конический прозрачный флакон объемом 1,5 или два миллилитра.
Затем добавьте второй компонент контролируемым образом в непрерывной работе с пипеткой 100 микролитров и перемешайте содержимое непосредственно с помощью пипетки, чтобы взять жидкость и добавить ее снова. Затем добавляют раствор G R G D S P C к взаимосвязанной структуре, чтобы модифицировать все оставшиеся эпоксидные группы клеточным адгезивным пептидом, несущим свободный амин и таял, и оставляют при комнатной температуре на ночь. Затем удалите непрореагировавшие молекулы, промыв деионизированной водой и удалите супернатант.
После снижения уровня воды откройте флакон и де этрифицируйте ультрафиолетовым светом длины волны, от 250 до 300 нанометров. Затем закройте флакон и перенесите флакон на чистую скамейку. После этого промыть стерильной водой.
Замените воду во флаконе средой для культивирования клеток и обеспечьте уравновешивание в течение пяти минут. Затем переложите макропористый каркас в пластину клеточной культуры для эксперимента, налив или используя шпатель. Конфокальная микроскопия показала, что 3D-макропористая конструкция состояла из взаимосвязанных аминов и эпоксидных функционализированных микрогелевых стержней.
Конструкция демонстрирует компактную геометрию из примерно 10 000 микрогелевых стержней, сформированных в течение двух или трех секунд. Эффективный модуль Юнга аминов и эпоксидных микрогелевых стержней вместе с аминными и эпоксидными микрогелевыми сферами измеряется нано-углублением. Для обнаружения активных функциональных групп изотиоцианат флуоресцеина может быть использован для визуализации первичных аминогрупп, а изомер флуоресцеина амина может быть использован для маркировки эпоксидных групп.
Стержни микрогеля амина имеют размеры со средней длиной 553 микрометра и средней шириной 193 микрометра в деионизированной воде, что приводит к соотношению сторон примерно 3,0. Средние значения макропор и каркасов, состоящих из микрогелевых стержней, составляют 100 микрометров, причем 90% размеров пор варьируется от 30 микрометров до более 150 микрометров. Сфера, подобная микрогелям, приводит к кластерам с размерами пор от 10 до 55 микрометров со средним значением около 22 микрометров.
Описанные микрогелевые стержни предназначены для получения взаимосвязанных микропоровых каркасов путем случайного перемешивания. Контролируемая процедура смешивания может позволить в будущем изготовить более индивидуальную геометрию каркасов. Жесткость микрогелей и биохимических сигналов может варьироваться в зависимости от требований продаж.
Комбинируя различные строительные блоки, можно достичь широкого спектра геометрий и свойств в рамках одного каркаса. Таким образом, мы можем эффективно нацеливаться на конкретные клетки для формирования многоклеточных тканей.
