В этом видео описан протокол для создания и использования сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как Drydux, которые эффективно способствуют трансдукции активированных Т-клеток. Drydux предназначен для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с покрытием RetroNectin, засеянных вирусом, и упрощает процесс преобразования клеток. Drydux обладает эффективностью трансдукции, сравнимой со спинокуляцией на пластинах с покрытием RetroNectin, и служит более дешевой и удобной альтернативой обычному методу трансдукции.
Сначала готовят 0,4% раствор кальция-D-глюконата. Добавьте стерильную фильтрованную воду DI к кальцию-D-глюконату в стакане. Перемешивайте на средней скорости до тех пор, пока кальций-D-глюконат не растворится, что занимает примерно 1 1/2 часа.
После растворения стерильно фильтруют раствор кальция-D-глюконата. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре. Далее готовят 2% раствор альгината.
Это может быть достигнуто с помощью флакона с винтовой крышкой или стакана. Оба будут показаны здесь. Осторожно добавьте ультрачистый альгинат в сосуд.
Добавьте соответствующее количество воды DI к альгинату. Выберите самый большой перемешивание, который не будет препятствовать смешиванию, и добавьте его в сосуд. Размешайте раствор до тех пор, пока альгинат не растворится, что занимает примерно один час.
Если на борту судна есть большие альгинатные скопления, наклоните судно вбок, чтобы выбить их. Небольшие комочки будут растворяться в течение часа, и не являются поводом для беспокойства. Как только 2%-ный раствор альгината растворится, уменьшите скорость перемешивания.
Медленно добавляют равный объем раствора кальция-D-глюконата в раствор альгината. Медленное добавление поможет предотвратить образование слипших сгустков. Когда раствор кальция-глюконата будет добавлен, увеличьте скорость перемешивания и энергично перемешивайте в течение 15 минут.
Наклоните судно вбок, чтобы удалить любые скопления, которые могли образоваться. После энергичного перемешивания в течение 15 минут убедитесь, что в растворе нет комочков. Пипетка раствора в 48 или 24-луночную пластину.
Для 48-луночной пластины пипетка по 300 микролитров в каждую скважину. Следите за тем, чтобы отливать медленно и часто менять наконечники, так как раствор будет вязким и может прилипнуть к кончику. Для 24-луночной пластины пипетка по одному миллилитру в каждую скважину.
Опять же, бросайте медленно и часто меняйте наконечники пипеток. Накройте плиты колодца крышкой и заморозьте при минусе 20 градусов цельсия на ночь. Подготовьте пластины для лиофилизатора, сняв крышки и закрепив верх салфетками и резинками.
Поместите пластины в трубку лиофилизатора и наденьте лиофилизатор на 72 часа. Через 72 часа снимите пластину с лиофилизатора. Теперь строительные леса готовы к использованию для трансдукции.
Если каркасы не используются немедленно, запечатайте пластину парапленкой и храните при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока это не понадобится. Для длительного хранения рекомендуется вакуумная герметизация пластины в дополнение к герметизации парапленкой. Концентрат вирусного супернатанта путем центрифугирования двух миллилитров вирусного раствора через центробежный фильтр по 1 500 г в течение 10 минут.
На каркас необходимо от 100 до 200 микролитров концентрированного вируса. Вращайтесь в течение нескольких дополнительных минут, если объем концентрированного раствора вируса превышает 200 микролитров. Для каждого каркаса сделайте аликвоту из 1 миллиона активированных Т-клеток, взвешенных в 50 микролитрах полной клеточной культуральной среды.
Добавьте концентрированный вирус в клеточную суспензию. Общий объем суспензии клеточного вируса не должен превышать 200 микролитров для 48-луночного каркаса или 350 микролитров для 24-луночного каркаса. Добавьте смесь клеточных вирусов по каплям в верхнюю часть сухого каркаса.
Для экспериментов с отрицательным контролем используйте полную клеточную культуральную среду вместо концентрированного вируса. Добавьте эту клеточную суспензию в верхнюю часть сухого каркаса. Инкубируйте каркасы в инкубаторе клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45-60 минут.
Извлеките каркасы из инкубатора. Каркасы должны полностью впитывать раствор в течение этого времени. Чтобы вызвать пролиферацию, добавьте полную среду клеточного культивирования, дополненную IL-7 и IL-15, в каждую лунку.
Также может использоваться Ил-2. Для 24-луночного каркаса добавьте один миллилитр. Для 48-луночного каркаса добавьте 500 микролитров.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов. Клетки будут размножаться в течение 72 часов, что может сделать медиа оранжевым. Удалите лишние носители из каждой лунки.
Чтобы изолировать клетки от каркаса, добавьте 0,25 молярного раствора ЭДТА к каждому каркасу. Добавьте один миллилитр для 24-луночных лесов или 300 микролитров для 48-луночных лесов. Дайте тарелке постоять или осторожно перемешайте в течение трех-четырех минут.
После того, как пипетка в основном растворилась, пипетка осторожно входила и выходила внутрь колодца. Для полного растворения каркаса может потребоваться несколько этапов пипетирования. Переложите раствор в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Дважды промыть ячейки PBS. Добавьте 12 миллилитров PBS в каждую трубку центрифуги. Центрифуга по 400 г в течение пяти минут.
Ячейка гранулы будет образовываться в нижней части трубки. Аспирируйте раствор надосадочного вещества и повторите промывку. Будьте осторожны, чтобы полностью удалить супернатант с каждой стиркой, так как очень важно избавиться от всех ЭДТА.
После промывки PBS во второй раз, гранула клетки готова к анализу. Проточная цитометрия использовалась для определения эффективности трансдукции каждой группы. Нетрансдуцированные клетки использовались в качестве отрицательного контроля и не показали трансдукции.
Клетки, посеянные на каркасах без ретровируса GFP, также не показали трансдукции. Группа Драйдукса, которая активировала клетки, посеянные на сухие макропористые альгинатные каркасы, показала 85% трансдукции, чуть ниже, чем группа RetroNectin. Эти результаты демонстрируют, что каркасы Drydux эффективно трансдуцируют клетки путем переноса ретровирусных генов без необходимости спинокуляции пластин, покрытых retroNectin.
Каркасы Drydux демонстрируют высокую эффективность трансдукции, сравнимую с RetroNectin, обеспечивая альтернативный метод преобразования Т-клеток. Из-за низкой стоимости производства каркасов Drydux этот процесс может значительно снизить стоимость терапии Т-клетками CAR.
