Этот протокол обеспечивает высокую пропускную способность для изучения межмолекулярного связывания между ДНК и лигандами. Этот метод продемонстрировал высокую пропускную способность при исследовании массивного набора биомолекулярных структур. Он делает это путем преобразования механических химических свойств отдельных молекул в свойства молекулярных ансамблей.
Я думаю, что это очень шаг вперед, но есть несколько критических шагов. Например, выравнивание микроскопа, гомогенизатора и реакционной трубки. Эти три вещи должны быть идеально выровнены, чтобы точно отслеживать изменение флуоресценции.
Начните с сборки гомогенизатора и микроскопа на монтажном столе. После ношения очков включите флуоресцентный микроскоп, а затем отрегулируйте гомогенизатор, чтобы убедиться, что луч света возбуждения проходит через центр диспергирующего наконечника гомогенизатора. Затем подготовьте реакционную камеру с плоским дном, которая составляет пять сантиметров в высоту и 1,5 на 1,5 квадратных сантиметра в поперечном сечении, следя за тем, чтобы выбранный материал камеры не флуоресцировал для уменьшения фона.
После этого зажмите реакционную камеру на стадии образца флуоресцентного микроскопа, а затем отрегулируйте камеру, чтобы удерживать диспергирующий наконечник гомогенизатора, гарантируя, что наконечник находится немного выше нижней поверхности реакционной камеры. Затем отрегулируйте вертикальное положение гомогенизатора и камеры вместе, чтобы фокус микроскопа находился на поверхности диспергирующего наконечника. Затем отрегулируйте горизонтальное положение диспергирующего наконечника, чтобы убедиться, что область обнаружения установлена между ротором и статером.
Включите флуоресцентные каналы, в соответствии с флуоресцентным красителем, используемым в эксперименте. Перед экспериментом по высокоскоростной стрижке использовал деионизированную воду для проверки сдвига с низкой скоростью сдвига. Во-первых, подготовьте человеческую теломерную i-мотивную ДНК, помеченную красителем и гасителем на двух концах соответственно в деионизированной воде, как описано в рукописи.
Далее разводят ДНК до пяти микромоляров в 30-миллимолярном MES-буфере при рН 5,5 или рН 7,4. К раствору ДНК добавляют лиганд L2H24OTD" в диапазоне концентраций от нуля до 60 микромоляров и аккуратно перемешивают раствор в течение 10 минут, чтобы сложить структуры i-мотива без света. Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой, с помощью флуоресцентного микроскопа без сдвига.
Затем установите параметры ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения со временем экспозиции 0,5 секунды, чувствительностью ПЗС 1 600 и временем записи, равным 20 минутам. Используя длинную пипетку, добавьте раствор ДНК в пустую и чистую реакционную камеру и накройте реакционную камеру черным ящиком. Затем запустите гомогенизатор для выполнения сдвига с выбранной скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 в секунду до 97 245 в секунду в течение 20 минут, с включенной ПЗС-камерой для записи данных.
После эксперимента снимите камеру и промыть ее деионизированной водой. Подготовьте ДНК i-мотива и деионизированную воду. Затем инкубируют 10 микромолярной i-мотивной ДНК и 300 микролитров 30-миллимолярного трис-буфера, дополненного 150 микромоляльным хлоридом меди и 300 микромолярной аскорбиновой кислотой в течение 10 минут, чтобы сложить структуры i-мотива.
Далее ультрафильтруют раствор с помощью ультрафильтрационного устройства с центробежной силой 14,300 раз больше G. Пополняйте раствор примерно до 500 микролитров с 30 миллимолярными трисовыми буферами, дополненными 300 микромолярной аскорбиновой кислотой после каждой фильтрации. После сбора остаточного раствора сделайте окончательный объем в 300 микролитров, добавив 30 миллимолярных трис, дополненных 300 микромолярной аскорбиновой кислотой вместе с 20 микромолярами CalFluor 488 Azide, 20 микромолярными HPG и 10 микромолярными TBTA. После того, как реагенты добавлены, переместите раствор в темное помещение.
Затем проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой, с помощью микроскопа перед экспериментами по сдвигу. Далее добавляют раствор ДНК в пустую реакционную камеру с длинной пипеткой, а затем запускают сдвиг гомогенизатора со скоростью сдвига 63,209 в секунду в течение 20 минут с включенной ПЗС-камерой. После эксперимента снимите камеру и промыть ее деионизированной водой.
Наблюдалось, что интенсивность флуоресценции ДНК i-мотива увеличивается со скоростью от 9 724 в секунду до 97 245 в секунду в буфере рН 5,5 MES. Однако интенсивность флуоресценции не увеличивалась при сдвиге той же i-мотивной ДНК со скоростью 63,209 в секунду, так как она не складывается при рН 7,4 в буфере MES. Было оценено связывание лиганда с молекулами i-мотива ДНК, подвергшимися чистому потоку, которое показало, что увеличение интенсивности флуоресценции стало менее очевидным с увеличением концентрации лиганда.
Константа диссоциации была определена для взаимодействия между лигандом и i-мотивом и оказалась 34 микромолями. Хелатный i-мотив меди был развернут со скоростью сдвига 63, 209 в секунду, а выпущенный медный вызвал флюоргенную реакцию щелчка, что привело к увеличению интенсивности флуоресценции с течением времени. Во-первых, убедитесь, что область обнаружения установлена между ротором и статером.
Во-вторых, проверьте и минимизируйте фон флуоресценции. И, наконец, убедитесь, что вы фильтруете реакцию, прежде чем выполнять реакцию щелчка. Этот метод открывает ворота для изучения механической прочности, складывания и разворачивания всех видов полимеров.
Это могут быть другие структуры ДНК, белки или другие полимеры и их взаимодействие с другими видами молекул. Как уже было сказано, несколько других макромолекул могут быть изучены с использованием этого подхода.
