Одномекулярная силовая спектроскопия может дать огромное представление о молекулярной биологии в атомном масштабе, позволяя нам манипулировать одиночными молекулами силой. Здесь мы демонстрируем постоянное измерение скорости с помощью атомного силового микроскопа. В конечном счете, мы можем использовать данные для определения стабильности белка, скорости раскрытия и разворачивающегося пути.
Чтобы начать процедуру, прикрепите непроводяную клеевую вкладку к чистому, шириной 15 миллиметров железному диску. Снимите крышку листа и твердо нажмите чистый, неокрашенный, или с золотым покрытием стеклянную горку на открытый клей. Храните слайд в чистой, покрытой чашкой Петри.
Затем сконцентрируйте очищенный полипротеин в центробежном фильтре, затем переверните столбец и перевестите белок в буфер, который будет использоваться в эксперименте. Определите соответствующую концентрацию белка на основе поглощения на 280 нанометров, а затем приготовьте 100 микролитров 100 микрограмм на миллилитр раствора белка. Нанесите 60 микролитровую каплю белкового раствора на центр слайда.
Позаботьтесь о том, чтобы жидкость не проскользнула между слайдом и железным диском, так как это приведет к неконтролируемым движениям образца во время эксперимента. Пусть образец сидит при комнатной температуре, по крайней мере 10 минут. Во-первых, тщательно подобрать кантилевер к концу и поместить его в ячейку зонда.
Убедитесь, что кантилевер прочно сидит. Затем поместите камеру в голову AFM. Установите голову на перевернутой стадии микроскопа и подключите батарею к голове AFM для питания лазера.
Настройка камеры для детектора микроскопа для визуализации лазерного света на мониторе или экране телевизора. Руководствуясь микроскопом, распорежь лазер так, чтобы он был направлен на кончик кантилевера. Как только образец будет готов, смойте 10 микролитров буфера эксперимента в каждый порт ячейки, удерживаваемой зондом.
Декант около 40 микролитров жидкости из образца слайд и добавить 40 микролитров буфера. В то же время, начать подготовку атомной микроскоп силы для измерения. Во-первых, поместите слайд на магнит над мотором пьезо.
Подтвердите, что этап AFM находится в повышенном положении, а затем поместите головку AFM на сцену с кантилевером над каплей образца. Затем поместите небольшой листок бумаги перед фотодиодом AFM. Отрегулируйте лазер до тех пор, пока пятно на бумаге не будет ярким и сфокусированным, а затем удалите бумагу.
Запустите программное обеспечение AFM для просмотра сигнала с фотодиода. Отрегулируйте головное зеркало AFM таким образом, чтобы лазерный сигнал был максимизироваен во всех четырех квадрантах фотодиодов, а другой сигнал между верхней и нижней квадрантными парами обнулен. Чтобы начать калибровку AFM, включите настройку фильтра для головного сигнала AFM до полной пропускной способности и убедитесь, что пьезо выключен.
В программном обеспечении AFM, измерить в среднем 512 расчетов спектра мощности, с 1024 точек данных на расчет. Интегрируйте спектральную плотность мощности через первый пик, что соответствует основному режиму вибрации для кантилевера. Затем включите контроллер пьезо и установите фильтр до 500 Герц.
Быстро перемещать голову AFM вниз несколько сотен микрометров при мониторинге различных сигналов. Продолжайте двигать головой вниз несколько сотен микрометров за один раз, наблюдая за последовательными прыжками в различных сигналах. Когда скачки сигнала начинают увеличиваться в высоту, кончик находится очень близко к поверхности образца.
После того, как сигнал отклонения насыщает при контакте кончика с поверхностью, поднимите голову немного, а затем настроить напряжение пьезо, чтобы переместить голову AFM вверх или вниз на 100 до 5000 нанометров, чтобы найти поверхность образца. После этого проведем потянув эксперимент с сканированием размером около 500 нанометров, так что кончик контактов поверхности, или около 100 нанометров пьезо двигатель путешествия. Используйте результаты для расчета пружинной постоянности и чувствительности.
В программном обеспечении установите размер сканирования на 40%больше, чем общий теоретический размер разворачивающегося полипротеина. Распоитите кантилевер так, чтобы он был на 80% от размера сканирования от поверхности. Установите скорость сканирования до 300 нанометров в секунду.
Выполните потянув эксперимент и измерить в результате пьезо позиции и фотодиод сигнала. Добавьте буфер эксперимента к жидкости клетки почасово на протяжении всего измерения, чтобы сохранить образец от высыхания. Разворачивающиеся события в записях полипротеина I91 и полипротеина, в котором три домена I91 обрамляли молекулу NI10C с каждой стороны, были оснащены червь-подобной цепной моделью.
Обе записи показывают характерную силу и длину контура шагом I91, что указывает на то, что калибровка AFM была успешной. Записи полипротеина, содержащего молекулу N110C, показали достаточное количество событий I91, чтобы подтвердить, что новые события были из белка интереса разворачивается. Средняя длина контура для повторения анкирина составила около 10,5 нанометров, а разворачивающиеся силы были между 8 и 25 пиконьютонами.
Очень важно использовать полипротеин, потому что разворачивающиеся события фланговых белков обеспечивают положительный контроль для отпечатков пальцев одного события молекулы. Без этого данные могут быть неправильно истолкованы.
