Эта новая органоидная модель человеческого зуба обеспечивает первый мощный инструмент для расшифровки биологии стволовых клеток зубов человека с перспективами регенеративного применения зубов. В настоящее время эта зубная органоидная модель является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расширения эпителиальных стволовых клеток зубов человека. Этот органоидный протокол может быть применен для создания исследовательских моделей не только здоровых, но и больных зубов, таких как опухоли зубов и бактериальное воздействие.
Исследование таких моделей заболеваний может выявить новые терапевтические цели. Эта органоидная модель играет важную роль в расшифровке процесса образования эмали в зубе человека и может позволить конструировать части зуба, такие как эмаль, для генеративных целей. Продемонстрировать процедуру будет Лара Хемерик, аспирант в моей исследовательской группе.
Для начала соберите третьи моляры с ассоциированными зубными фолликулами в коллекционную среду, помещенную на лед, и перенесите содержимое трубок в чашку Петри. Удерживайте зуб пинцетом и тщательно изолируйте зубные фолликулы с помощью хирургического лезвия. Смойте оставшуюся кровь с зубных фолликулов, ненадолго поместив ткани зубного фолликула в первую лунку с 70% этанолом на 20 секунд, затем перенесите ее на следующую пластину этанола смерти на 20 секунд и далее в третий этаноловый колодец.
Продолжайте промывать его в фосфатно-буферных солевых колодцах три раза, а затем промывать зубные фолликулы в трех оставшихся зубных фолликулах в средних колодцах сбора в течение максимум 20 минут в общей сложности. Перенесите промытые зубные фолликулы в новую чашку Петри. Вырежьте небольшой кусочек одного из зубных фолликулов для фиксации параформальдегида и храните его в микроцентрифужной трубке, содержащей 500 микролитров среды для сбора, в течение максимум шести часов.
Измельчите остальные зубные фолликулы на мелкие кусочки и переложите их в 15-миллилитровую трубку, содержащую четыре миллилитра предварительной диссоциационной среды, затем высиживают трубку при 37 градусах Цельсия в течение двух часов на водяной бане. Каждые 15 минут пипеткой исследуйте среду диссоциации зубных фолликулов и смешивайте вверх и вниз с помощью стеклянной пипетки, чтобы ускорить распад тканей. Когда кусочки зубных фолликулов больше не наблюдаются, приступайте к диссоциации с помощью суженной, отполированной огнем пипетки Пастера.
Тем временем готовят 10 миллилитров среды А, содержащей 100 микролитров ДНКазы, и добавляют пять миллилитров этой среды в каждую трубку с диссоциированными зубными фолликулами. Инкубировать в течение одной минуты при комнатной температуре. Смойте фильтр одним миллилитром среды А.На этом этапе соедините несколько трубок диссоциированных зубных фолликулов одного пациента и центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию в 200 раз в г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
Удалите супернатант. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре безсыворочной определенной среды и перенесут клеточную суспензию в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку. Рассчитайте концентрацию ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек и рассчитайте количество скважин, которые могут быть засеяны.
Конечная смесь состоит из клеточной суспензии и матрицы базальной мембраны в соотношении 30 к 70. Удалите соответствующее количество супернатанта и медленно повторно суспендируйте его, чтобы получить соотношение 70 к 30 ледяной матрице базальной мембраны к клеточной суспензии для покрытия. После повторного суспендирования в матрице базальной мембраны держите трубку микроцентрифуги на льду, чтобы избежать затвердевания матрицы базальной мембраны.
Пипетка 20 микролитров базальной мембраны матричной капли в центр предварительно нагретой 48-луночной культуральной пластины. Переверните пластину вверх дном и поместите ее для затвердевания в инкубаторе углекислого газа 1,9% при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. Добавьте rho-ассоциированный ингибитор киназы и амфотерицин B в органоидную среду зуба и предварительно разогрейте среду на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия.
Возьмите 48-луночную пластину из инкубатора. Поместите его вертикально и добавьте 250 микролитров подготовленной предварительно расплавленной среды в каждую лунку с помощью капли матрицы базальной мембраны, содержащей клетки, и верните пластину в инкубатор углекислого газа. Чтобы освежить среду, наклоните пластину под углом 45 градусов.
Аккуратно удалите предыдущую среду, избегая при этом прикосновения к капле матрицы базальной мембраны и добавляйте 250 микролитров новой предварительно расплавленной зубной органоидной среды каждые два-три дня. Чтобы осуществить прохождение органоидов, удаляют среду из лунок с органоидами и объединяют до четырех сливающихся лунок. Чтобы собрать органоиды, добавьте 400 микролитров ледяной сывороточной определенной среды на лунку непосредственно на каплю мембранного матрикса и многократно пипеткой на среду вверх и вниз, пока вся капля не будет смещена.
Если скважины объединены, перенесите 400 микролитров из первой скважины в следующую, чтобы выбить органоид, содержащий капли. Перенесите смещенную органоидную сборку в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 микролитра и повторите добавление безсыворочной определенной среды до тех пор, пока все органоидные структуры не будут собраны из скважин. Центрифугируйте его в 200 раз г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия.
Извлеките супернатант из трубки центрифуги и повторно суспендируйте гранулу в предварительно расплавленной аликвоте TrypLE Express. Добавьте 400 микролитров ледяной безмятежной определенной среды, чтобы инактивировать фермент и центрифугировать его в 200 раз в г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант.
Предварительно покройте наконечник ледяной безмятежной определенной средой и повторно суспендируйте органоидную гранулу в стерильном состоянии. Повторно суспендировать гранулу в 200 микролитрах ледяной сыворотки без определенной среды для метода с низким проходом. Прижмите полностью опорожненный наконечник пипетки к нижней части трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить ее диаметр.
Пипетка вверх и вниз в течение пяти минут, чтобы механически нарушить работу органоидов. Для метода с более высоким проходом повторно суспендируйте гранулу в 700 микролитров ледяной сывороточной определенной среды с наконечником P1000. Добавьте наконечник P200 к этому наконечнику P1000 и предварительно покройте ледяной сывороточной средой.
Предотвратите образование пузырьков воздуха, регулируя настройку громкости пипетки. Стремитесь по крайней мере на 90% объема среды с органоидами и пипеткой вверх и вниз в течение пяти минут, чтобы механически разрушить органоиды. Органоиды обычно развиваются через две недели после посева клеток зубного фолликула.
Органоиды имеют длительное расширение до 11 проходов. Посев около 20 000 клеток на каплю матрицы базальной мембраны дает оптимальную плотность органоидов, тогда как посев более высоких чисел клеток приводит к неоптимальному органоидному росту с аналогичными органоидами при слишком высокой плотности из-за недостаточного пространства для роста. Развитые органоиды показывают плотный вид и содержат клетки, демонстрирующие высокое нуклеоцитоплазматическое соотношение.
Кроме того, органоиды экспрессируют маркер ERM цитокератин 14, подтверждающий их эпителиальное происхождение и другие предложенные маркеры ERM, такие как P63, CD44 и интегрин альфа-6. Органоиды экспрессируют SOX2, хорошо известный маркер DESC у мышей. Интересно, что основной компонент эмалевого матрикса, амелогенин, также экспрессируется в органоидах.
Органоиды сохраняют фенотип ствола ERMM во время пассирования, о чем свидетельствует стабильная экспрессия маркеров. Для оптимального долгосрочного роста органоидов важно использовать рекомендуемые методы прохода, означающие или методы низкого прохода или методы более высокого прохода. После образования органоиды могут быть использованы для дальнейшего изучения процесса амелогенеза и осаждения эмалевой матрицы, которое в настоящее время не достигается в стоматологических исследованиях.
Этот метод позволяет исследовать биологию зубных эпителиальных стволовых клеток, процесс образования эмали и взаимодействие с мезенхимой зуба, взаимодействие, необходимое для правильного формирования зубов.
