Этот протокол позволяет использовать уменьшенное количество клещей, что снижает затраты на содержание колонии и уменьшает количество позвонков животных, необходимых для кормления клещей. Этот протокол требует приблизительно 20 тиков. Однако основным преимуществом, помимо использования небольшого размера выборки, является то, что этот протокол может быть применен к нескольким видам клещей и различным стадиям жизни.
Помимо вскрытия клещей или применения к взаимодействиям хозяина и паразита, влияние патогенной инфекции на секрецию микроРНК и влияние физиологических изменений на микроРНК, секретируемую клещами. Для начала приготовьте среду без пузырьков, добавив фетальную бычью сыворотку, триптозофосфатный бульон, 10% концентрат холестерина липопротеинов, 5% бикарбонат натрия, HEPES и среду L15C300 в бутылку с поликарбонатной центрифугой объемом 26,3 миллилитра и отрегулируйте объем по мере необходимости. Теперь ультрацентрифугируйте среду в 100 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 18 часов.
Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и перенесите супернатант в свежую трубку центрифуги. Еще раз ультрацентрифугируйте трубку. Возьмите супернатант и пропустите его через фильтр 0,22 микрометра, чтобы удалить загрязняющие вещества.
Пипетка супернатанта в 50-миллилитровую центрифужную трубку и храните его при минус 20 градусах Цельсия до тех пор, пока потребуется или до трех лет. Добавьте соответствующее количество антибиотиков к 500 микролитрам среды без пузырьков в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины. Теперь добавьте PBS с рифампицином в лунки, которые не содержат среду без пузырьков, чтобы предотвратить рост бактерий.
Поместите клещей на стеклянную горку с помощью двусторонней ковровой ленты под рассекающим микроскопом. Перед рассечением добавьте pBS, содержащий рифампицин, к клещу и, используя четырехмиллиметровые ножницы Vannas, сделайте разрез примерно в один миллиметр на стороне каждой самки. Теперь удалите спинную сторону клеща и слюнные железы, затем поместите от 20 до 40 слюнных желез клеща в 500 микролитров среды без пузырьков, добавленных в одну лунку в 24-луночную обработанную ткань.
Инкубируйте образцы слюнных желез при 32 градусах Цельсия в течение 24 часов, чтобы обеспечить секрецию внеклеточных везикул. В конце инкубации пипетку всей среды, содержащей слюнные железы, в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и центрифугу в 300 раз больше G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Повторно суспендировать гранулы, содержащие слюнные железы в РНК, позже и хранить при минус 80 градусах Цельсия до использования или неопределенно долго. Теперь удалите клеточный мусор, центрифугируя супернатант в 2000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и пипетку супернатанта в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Затем центрифугируют в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить апоптотические тела и более крупные внеклеточные везикулы и перенести супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Затем соберите одномикрометровый нейлоновый шприцевый фильтр на 10-миллилитровом шприце и держите его на ультрацентрифужной трубке. Затем добавьте образец и заполните шприц 10 миллилитрами PBS. Пропустите супернатант через фильтр в трубку.
После фильтрации и балансировки труб поместите их в ротор 70 Ti и ультрацентрифугируйте трубы в 100 000 раз G в течение 18 часов при четырех градусах Цельсия. Концентрированные внеклеточные везикулы образуют гранулу после ультрацентрифугирования. Удалите супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в PBS.
Пипетка 500 микролитров внеклеточного пузырька в центробежный фильтр 300 К и центрифугу в 8 000 раз G в течение 10 минут при температуре окружающей среды и повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все внеклеточные везикулы не будут отфильтрованы. Наконец, добавьте 400 микролитров стерилизованного PBS в колонку и тщательно перемешайте, чтобы удалить внеклеточные везикулы, прикрепленные к мембране. Затем поместите образец в 1,5-миллилитровую трубку, свободную от ДНК.
Концентрация и размер внеклеточных пузырьков варьировались в зависимости от пола и стадии жизни клещей между биологическими репликами для самок, самцов и нимф. Для всех комбинированных биологических реплик наблюдались аналогичные результаты. Анализ малых РНК, выделенных из слюнной железы, показал полосы, соответствующие рибосомным РНК и микроРНК.
Однако рибосомные РНК отсутствовали в везикулах, выделенных из слюнных желез, а образцы микроРНК, очищенные от внеклеточных везикул, показали большую деградацию. После обогащения образцы микроРНК, очищенные от EV, показали минимальную деградацию и достаточную концентрацию микроРНК для синтеза библиотеки кДНК. Ожидаемый размер полосы около 150 пар оснований после получения библиотеки кДНК означает небольшие библиотеки РНК-кДНК.
Во время приготовления без пузырьков следите за действиями по предотвращению наружного загрязнения пузырьков. Во время приготовления колодца обязательно добавляйте антибиотики, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение из микробиома клеща. МикроРНК, извлеченные с использованием этого протокола, могут быть использованы для профилирования и функциональных экспериментов по проверке ролей микроРНК, таких как прогнозирование мишеней пути микроРНК, ингибирование и эксперименты по мимикрии.
