Этот протокол важен, потому что он обеспечивает способ выделения внеклеточных везикул из различных бактерий высоко воспроизводимым способом. Самое замечательное в этом методе заключается в том, что его можно использовать для выделения электромобилей из довольно больших сред бактериальных культур, что позволит проводить исследования in vivo. Хотя данные, которые мы показываем, отражают доклинические приложения, можно предвидеть, что этот протокол может быть адаптирован для производства бактериальных EV для терапии.
Этот метод может быть применен к любой масштабируемой системе клеточных культур с незначительными изменениями. Из-за масштабируемости протокола важно иметь фильтры соответствующего размера и столбцы SEC для обработки желаемых начальных объемов культуры бактериальных клеток. Процедуры демонстрируют Сэди Джонсон, помощник технолога в лаборатории доктора Джастина Латии, Дионисиус Уотсон, специалист по онкологии в лаборатории доктора Джастина Латии, и Аким Сантос, технолог-исследователь в моей лаборатории.
Начните с инокуляции одиночных колоний кишечной палочки в 250-1000 миллилитров Лурии-Бертани, или бульона LB, используя стерильную петлю. Затем высиживают культуру аэробно в трясущемся инкубаторе со скоростью 300 оборотов в минуту и 37 градусами Цельсия. После 48 часов инкубации осветляют бактериальную питательную среду путем переноса клеточных культур в чистые 500-миллилитровые полипропиленовые центрифужные бутылки для центрифуги в роторе большой емкости с фиксированным углом при четырех градусах Цельсия и 5 000 раз G в течение 15 минут.
Переложите супернатант в чистые бутылки центрифуги, тщательно вылив в центрифугу по 10 000 G в течение 15 минут. Затем перенесите супернатант на 0,2-микронный фильтрующий прибор с вакуумным приводом от полиэфирсульфона соответствующего размера и подключите фильтрующее устройство к вакуумной стенке питания. Если скорость фильтрации значительно падает, переместите нефильтрованный материал на новое устройство.
Отфильтрованная среда может храниться при четырех градусах Цельсия в течение ночи или может быть немедленно обработана. Чтобы проверить полное удаление жизнеспособных клеток, распределите аликвоту фильтрованного супернатанта на подходящие агаровые пластины и обеспечьте отсутствие каких-либо колоний после инкубации в оптимальных условиях для бактериального штамма. Для концентрирования фильтрованной среды объемом 100 миллилитров загружают 90 миллилитров фильтрованной питательной среды в резервуар центробежного ультрафильтрационного устройства с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон и центрифугируют среду в качающемся роторе ковша при четырех градусах Цельсия и 2 000 раз G с интервалом от 15 до 30 минут до тех пор, пока объем в верхнем резервуаре не будет сконцентрирован менее чем на 0,5 миллилитра.
Чтобы долить резервуар оставшейся фильтрованной питательной средой, удалите проточную в нижней части устройства для восстановления баланса. Если вязкость концентрированной среды в резервуаре заметно увеличена, разбавляют среду PBS и реконцентрируют центрифугированием, чтобы уменьшить любые неклетоклеточные пузырьки или белки EV, меньшие, чем отсечение молекулярной массы в 100 килодалтон. Затем перенесите концентрированную среду в трубку с низким содержанием белка для хранения при четырех градусах Цельсия в течение ночи Для концентрирования отфильтрованной среды с объемом более 100 миллилитров выберите тангенциальную фильтрацию соответствующего размера или устройство TFF с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон.
После сборки контура фильтрации, как описано в рукописи, закачайте 200 миллилитров PBS в градуированный сосуд, чтобы определить соответствующую скорость, соответствующую желаемому расходу. Когда скорость установлена, циркулируйте отфильтрованную кондиционированную среду со скоростью приблизительно 200 миллилитров в минуту при комнатной температуре и собирайте молекулы размером менее 100 килодальтон, пересекая ультрафильтрационную мембрану в качестве отходов в отдельном сосуде до тех пор, пока объем кондиционированной среды не будет уменьшен до 100-200 миллилитров. Последовательно разбавляйте отфильтрованный объем в два раза PBS и продолжайте циркуляцию среды с насосом в меньших сосудах, чтобы сконцентрировать объем до 75-100 миллилитров, а затем до 25 миллилитров и 10 миллилитров.
Поднимите питательную трубку из резервуара для проб и откачайте фильтр для очистки фильтра для извлечения максимального количества образца. Переместите концентрированный образец в 15-миллилитровое центробежное ультрафильтрационное устройство с отсечкой молекулярной массы 100 килодалтонов и центрифугу в качающемся роторе ковша при четырех градусах Цельсия и 2000 раз g с интервалом от 15 до 30 минут, пока объем среды в верхнем резервуаре не составит менее двух миллилитров. Перенесите концентрированную среду в трубку с низким содержанием белка, чтобы хранить при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
Для изоляции электромобилей выполняют эксклюзионную хроматографию размеров, или SEC, используя небольшую колонку с объемом слоя 10 миллилитров для менее 100 миллилитров исходного материала и большую колонну с объемом слоя 47 миллилитров для более чем 100 миллилитров исходного материала. За несколько часов до эксперимента доведите колонну SEC и PBS до комнатной температуры с последующей стабилизацией колонны в вертикальном положении с помощью стандартной лабораторной подставки и держателя. Перед подключением к колонне SEC гидратируйте резервуар для образцов, позволяя пяти миллилитрам PBS течь через фрит в контейнер для отходов.
Затем открутите впускную крышку колонны, чтобы добавить два миллилитра PBS в резервуар для проб и осторожно подключите резервуар к колонне, когда PBS капает через фрит. Для уравновешивания колонны добавьте 47 миллилитров PBS в резервуар для проб с последующим снятием нижней части колонны SEC. Затем позвольте всему загруженному буферу образцов пройти через столбец и отбросьте сквозной поток.
После загрузки двух миллилитров образца в резервуар для проб дайте образцу полностью войти в колонну и собрать проходной поток. Немедленно добавьте PBS в резервуар для образцов в объеме 14,25 миллилитра за вычетом объема образца, чтобы раствор протекал через колонну, отбрасывая при этом количество, равное объему пустоты колонны. Затем поместите двухмиллилитровую низкосвязанную микротрубку непосредственно под колонкой SEC, чтобы собрать первый сквозной или дробный, позволив двум миллилитрам PBS пройти через колонну.
Продолжайте добавлять два миллилитра PBS в резервуар для отбора проб для сбора каждой последующей фракции. Храните собранные фракции при четырех градусах Цельсия для краткосрочного хранения или минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения. Для проверки стерильности собранных фракций EV прививают три миллилитра питательной среды 100 микролитрами фракций, которые будут использоваться в анализах.
Затем культивируют среду в оптимальных условиях, соблюдая мутность в течение не менее трех дней. Альтернативно, образцы фракций могут быть нанесены на агаровые пластины, содержащие среду, используемую для выращивания продуцирующих бактерий, а затем проверить образование колоний. Затем храните EV, передавая от 25 до 50% отдельных или объединенных фракций в трубки с низким содержанием белка при минус 80 градусах Цельсия, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
Репрезентативный анализ показывает элюирование Escherichia coli MP1 EV в ранних фракциях хроматографии. Фракции от одного до шести содержали наибольшее количество электромобилей со средним диаметром ниже 100 нанометров. В то же время последующие фракции содержали белки без EV и очень мало EV.
Обогащение и размер EV были подтверждены просвечивающей электронной микроскопией, особенно в фракциях от двух до шести. Было отмечено, что обогащенные EV фракции от двух до семи обладают высокой активностью нанолюциферазы, но только очень низким флуоресцентным сигналом от не-EV-ассоциированного mCherry по сравнению с более поздними фракциями. Маркировка иммунозолотого подтвердила EV-ассоциацию нанолюциферазы во фракциях от двух до пяти.
Применимость протокола к другим видам бактерий оценивали путем выделения EV из культур различных анаэробных бактерий. Было отмечено, что ранние фракции хроматографии от одного до четырех были обогащены для электромобилей с размером диаметра менее 100 нанометров. Комплексная инфузия мозга и сердца, или BHI, содержала частицы ev-размера менее 25% от общего выхода EV.
Важно использовать устройства TFF, способные обрабатывать начальный объем культуры бактериальных клеток. Этот метод позволяет нам генерировать достаточное количество электромобилей, чтобы задавать биологические вопросы об их функции в сложных животных моделях.
