Этот протокол позволяет выявить межклеточную сигнальную картину кальция, которая характеризует реакцию каждого типа клеток как на здоровье, так и на болезнь. Этот метод позволяет быстро и детально биофизически охарактеризовать сложное клеточное поведение. Мы планируем использовать эту IgG-индуцированную кальциевую сигнализацию в качестве отпечатка пальца для персонализированной медицины нейровоспалительных заболеваний.
В реальной жизни нелегко увидеть и проследить за всеми процессами и событиями, особенно происходящими под микроскопом. Следовательно, визуальные данные важны. После обезглавливания от одного до трехдневного щенка обнажите череп, разрезав кожу с помощью небольших угловых ножниц.
Затем откройте череп, разрезав отверстие magnum к орбитам и сделайте перпендикулярный разрез средней линии. Извлеките мозг из черепа и поместите его в чашку Петри, содержащую PBS. Используйте кончик щипцов, чтобы разорвать связи между обоими полушариями, и разделите полушария изогнутыми щипцами, мягко толкая полусферу от центра к стороне.
Используйте прямые и изогнутые щипцы, чтобы удалить мозговые оболочки, осторожно разрывая их. Затем удалите гиппокамп, зажав его изогнутыми щипцами, и выбросьте, или используйте его для другого препарата клеточной культуры. Затем переведите кору в 15-миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра холодного PBS, и гомогенизируйте ткань, пипетируя вверх и вниз от 10 до 15 раз с помощью одномиллилитрового наконечника.
Центрифугировать клетки по 500 г в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах холодного PBS путем пипетки с помощью одномиллилитрового наконечника. Центрифугу еще раз и повторно суспендировать гранулу в двух миллилитрах полного DMEM, дополненного 10% FBS и антибиотиками.
После переноса гомогената в двухмиллилитровую трубку пропустите гомогенат через иглы 21 и 23 калибра, чтобы получить суспензию одиночных ячеек. Вылейте клеточную суспензию, приготовленную из одной коры, в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую три миллилитра полного DMEM, и слегка встряхните чашку Петри, чтобы суспензия равномерно распределилась. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа и 95% воздуха при 37 градусах Цельсия.
Чтобы стимулировать рост астроцитов, удалите старые среды и промывайте клетку предварительно подогретым PBS, чтобы удалить слабо прикрепленные глиальные клетки и следы FBS, как только они достигнут слияния от 70 до 80%. Затем трипсинизируют нижележащий слой астроцитов, добавляя один миллилитр предварительно подогретого раствора трипсина и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение двух-пяти минут. Используйте микроскоп, чтобы проверить, начинают ли клетки отделяться, и добавьте четыре миллилитра полного DMEM.
Соберите клеточную суспензию и переложите ее в 15-миллилитровую трубку. Затем центрифугируют пробирку по 500 г в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Далее приготовьте блюдо культуры и добавьте культуральную среду. Перекладывайте ячейки с плотностью от 10 до четвертого ячеек на квадратный сантиметр в пяти миллилитрах свежего полного DMEM и промывайте ячейки с полным DMEM перед каждой заменой среды.
После достижения 70-80% слияния повторите трипсинизацию и посейте пять раз от 10 до третьих астроцитов на семимиллиметровом круглом стеклянном покрытии с поли-L-лизином. Дайте им прикрепиться в течение 10 минут и добавьте полный DMEM. Используйте их в экспериментах через 48 часов.
После подготовки микроглиальных культур, чтобы способствовать микроглии, позвольте глиальным клеткам стать сливающимися, и микроглия появится поверх слоя астроцитов через 10-15 дней. Встряхните чашку Петри на орбитальном шейкере в течение двух часов при 220 оборотах в минуту. Теперь слегка промыть отсоединенные и слабо прикрепленные клетки, аспирируя супернатант с помощью наконечника пипетки в один миллилитр.
Осторожно распределите супернатант на слой клеток несколько раз, обеспечивая покрытие всей поверхности клеточного слоя во время этой стадии промывки. Соберите среду с отсоединенными клетками и переложите ее в 15-миллилитровую трубку. Центрифугирование, повторное суспендирование и подсчет клеток, как показано ранее.
Посейте пять раз от 10 до третьей микроглии на семимиллиметровом круглом стеклянном покрытии с поли-L-лизином. Дайте им прикрепиться в течение 10 минут и добавьте полный DMEM. Используйте их в экспериментах через 48 часов.
Чтобы промыть весь ДМЭМ, переложите один лист крышки на посуду с внеклеточным раствором. Готовят раствор для загрузки красителя путем разбавления одного миллимоляра Fluo-4 AM внеклеточным раствором для достижения конечной концентрации пяти микромоляров. Поместите крышку с ячейками в раствор для загрузки красителя на 30 минут при комнатной температуре в темноте и промыть клетки во внеклеточном растворе в течение 20 минут.
Поместите крышку в записывающую камеру с одним миллилитром рабочего раствора. Выберите поле зрения с постоянным количеством ячеек на протяжении всего эксперимента. Начните визуализацию и определите исходный уровень, получив базальный уровень флуоресценции в течение трех-пяти минут.
Затем остановите поток рабочего раствора и переключитесь на тестовый раствор на нужный промежуток времени. Между каждым исследуемым раствором промывайте ячейки постоянным потоком рабочего раствора в течение трех-пяти минут. Поддерживайте объем раствора в регистрирующей камере на уровне одного миллилитра, организуя постоянное всасывание из верхней части раствора.
Выберите кадр с наибольшей интенсивностью сигнала и обведите одну ячейку с помощью приложения инструмента «Полигональ». После окружения всех ячеек в полученном поле выберите пять интересующих областей в фоновом режиме с помощью инструмента «Круг». Затем измерьте среднюю интенсивность сигнала одной ячейки и фон для каждого таймфрейма.
Выберите все интересующие регионы и используйте команду Multi-Measure в ROI Manager в ImageJ или любую эквивалентную команду в коммерческом программном обеспечении. После импорта данных в программное обеспечение MATLAB усредните пять фоновых ROI и вычтите усредненный фон каждого кадра из средней интенсивности ROI кадров, полученных одновременно. Позже проанализируйте активность кальция, определив амплитуду пика кальция, интегральное изменение переходного периода кальция, время до пика, время подъема, половинную ширину и частоту.
GFAP используется для визуализации астроцитов, а Iba1 для визуализации микроглии. hSOD1G93A астроциты реагируют на иммуноглобулин G БАС с большей амплитудой переходного кальция, более значительным общим интегральным изменением и более коротким временем до пика, чем нетрансгенные астроциты. Ответ на БАС иммуноглобулин G отличается от ответа на АТФ.
hSOD1G93A астроциты имели более высокий уровень ионов кальция в запасах, что было выявлено истощением запасов, что указывает на перегрузку этого иона. Микроглию культивировали, и со временем извлекали среднюю интенсивность флуоресценции. Следы кальция трех клеток показали, что только одна клетка реагировала на иммуноглобулин БАС G, в то время как все клетки реагировали на АТФ.
Псевдоцветные изображения представляли интенсивность флуоресценции и исходный уровень в ответ на БАС, IgG и АТФ. Клетки должны быть адекватно загружены, а параметры системы визуализации должны быть соответствующим образом отрегулированы, чтобы сигнал не отделялся во время эксперимента. Наряду с выделением кальция может быть выполнено зажим пластыря.
Таким образом, можно получить более полную картину корреляции между различными мембранными ионными токами и выделением кальция. Понимание внутриклеточного гомеостаза кальция имеет важное значение для исследования нескольких реакций на естественные, а также на стрессовые и внешние раздражители.
