该协议允许揭示细胞间钙信号模式，表征健康和疾病中的每种细胞类型反应。该技术允许对复杂的细胞行为进行快速而详细的生物物理表征。我们计划使用这种IgG诱导的钙信号传导作为神经炎症性疾病个性化医疗的指纹。
在现实生活中，要看到和跟踪所有的过程和事件并不容易，尤其是在显微镜下发生的那些。因此，视觉数据很重要。斩首一到三天大的幼崽后，用小角度剪刀切开皮肤，露出头骨。
然后通过将大孔切向眼眶来打开颅骨，并进行垂直的中线切口。从头骨中取出大脑，并将其放入含有PBS的培养皿中。用镊子的尖端撕裂两个半球之间的连接，并通过轻轻地将半球从中心推到侧面，用弯曲的镊子将半球分开。
使用直镊子和弯曲的镊子小心地撕裂脑膜以去除脑膜。然后用弯曲的镊子捏住海马体，将其取出，丢弃，或将其用于另一种细胞培养制剂。接下来，将皮层转移到含有三毫升冷PBS的15毫升管中，并通过用1毫升吸头上下移液10至15次来均质组织。
将细胞以500g离心五分钟。弃去上清液，用一毫升吸头移液将沉淀重悬于三毫升冷PBS中。再次离心，并将沉淀重悬于两毫升补充有10%FBS和抗生素的完全DMEM中。
将匀浆转移到两毫升管中后，将匀浆通过 21 和 23 号针头以制成单细胞悬浮液。将从一个皮层制备的细胞悬液倒入含有三毫升完整DMEM的60毫米培养皿中，轻轻摇动培养皿，使悬浮液均匀分布。将细胞在含有5%二氧化碳和95%空气的加湿培养箱中以37摄氏度孵育。
为了促进星形胶质细胞的生长，去除旧培养基，并用预热的PBS洗涤细胞，以去除松散附着的神经胶质细胞和FBS痕迹，一旦它们达到70%至80%汇合。然后通过加入一毫升预热的胰蛋白酶溶液来胰蛋白酶消化星形胶质细胞的底层，并在37摄氏度下孵育两到五分钟。使用显微镜检查细胞是否开始分离，并加入四毫升完整的DMEM。
收集细胞悬液，并将其转移到15毫升管中。然后将试管以500g离心五分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于一毫升完全培养基中。
使用血细胞计数器计数细胞。接下来，准备培养皿并加入培养基。在5毫升新鲜的完全DMEM中以每平方厘米10至第四个细胞的密度重新铺板细胞，并在每次更换培养基之前用完全DMEM洗涤细胞。
达到70%至80%汇合后，重复胰蛋白酶消化，并在7毫米聚L-赖氨酸涂层的圆形玻璃盖玻片上接种5次10至第三个星形胶质细胞。让它们附着 10 分钟，然后添加完整的 DMEM。48小时后在实验中使用它们。
制备小胶质细胞培养物后，为了促进小胶质细胞，让神经胶质细胞汇合，小胶质细胞将在10至15天后出现在星形胶质细胞层的顶部。在轨道振荡器上以220 RPM摇动培养皿两个小时。现在，用一毫升移液器吸头吸出上清液，轻轻清洗分离和松散附着的细胞。
将上清液轻轻分配到细胞层上数次，确保在此洗涤步骤中覆盖整个细胞层表面。收集带有分离细胞的培养基，并将其转移到15毫升管中。如前所述离心、重悬和计数细胞。
在七毫米聚-L-赖氨酸涂层的圆形玻璃盖玻片上播种5次10至第三个小胶质细胞。让它们附着 10 分钟并添加完整的 DMEM。48小时后在实验中使用它们。
要洗掉完整的DMEM，请将一张盖玻片转移到装有细胞外溶液的培养皿中。通过用细胞外溶液稀释一毫摩尔Fluo-4AM来制备染料负载溶液，以达到五微摩尔的最终浓度。将带有细胞的盖玻片在室温下在黑暗中将细胞放入染料加载溶液中30分钟，并在细胞外溶液中洗涤细胞20分钟。
将盖玻片放入装有一毫升工作溶液的记录室中。选择在整个实验过程中具有一致细胞数的视野。开始成像并通过获取基础荧光水平三到五分钟来确定基线。
然后停止工作溶液的流动，并切换到测试溶液所需的时间长度。在每个测试溶液之间，用恒定流量的工作溶液洗涤细胞三到五分钟。通过从溶液顶部安排恒定的吸力，将记录室中的溶液体积保持在一毫升。
选择信号强度最高的帧，并使用多边形工具应用程序环绕一个像元。环绕采集场中的所有像元后，使用圆形工具在背景中选择五个感兴趣区域。然后测量单个单元格的平均信号强度和每个时间帧的背景。
选择所有感兴趣的区域，并使用 ImageJ 中 ROI 管理器中的"多测量"命令或商业软件中的任何等效命令。在MATLAB软件中导入数据后，平均5个背景ROI，并从同时采集的帧的平均ROI强度中减去每帧的平均背景。然后，通过确定钙峰的幅度，钙瞬态的积分变化，峰值时间，上升时间，半宽和频率来分析钙活性。
GFAP用于可视化星形胶质细胞，Iba1用于可视化小胶质细胞。hSOD1G93A星形胶质细胞对ALS免疫球蛋白G的反应与非转基因星形胶质细胞相比，钙瞬变幅度更大，整体综合变化更显着，达到峰值的时间更短。对ALS免疫球蛋白G的反应与对ATP的反应是可区分的。
hSOD1G93A星形胶质细胞在储存中具有更高水平的钙离子，如储存耗尽所揭示的那样，表明该离子过载。培养小胶质细胞，并随着时间的推移提取平均荧光强度。三个细胞的钙迹线表示只有一个细胞对ALS免疫球蛋白G有反应，而所有细胞对ATP有反应。
伪彩色图像表示响应ALS，IgG和ATP的荧光强度和基线。细胞需要充分加载，成像系统的参数需要适当调整，以便在实验过程中信号不分离。除了钙释放外，还可以进行膜片钳。
因此，可以获得不同膜离子电流与钙发射之间相关性的更完整的图片。对细胞内钙稳态的理解对于探索对自然以及压力和外部刺激的几种反应至关重要。
