Проточная цитометрия является мощным методом, который позволяет проводить многопараметрический анализ отдельных клеток. Он может точно и быстро идентифицировать биомаркеры раннего и позднего апоптоза, анализируя миллионы клеток. Несколько клеточных молекул окрашиваются и одновременно обнаруживаются.
В частности, настольная проточная цитометрия позволяет проводить анализ и интерпретацию непрофессиональными проточными цитометристами. Продемонстрацией процедуры будет Эстер Чжоу, аспирант из группы рака витамина D. Начните с выращивания клеточных культур в увлажненной среде CO2 при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2.
Убедитесь, что клеточная культура примерно на 70% сливается с родительской колбой, прежде чем передавать клетки для экспериментов. Извлеките средство из колбы и промойте ячейки 1X PBS. Затем добавьте один миллилитр трипсина, чтобы отделить клетки.
После того, как клетки начнут отделяться, нейтрализуйте трипсин, добавив примерно пять миллилитров свежей питательной среды с добавлением 10% сыворотки плода телята перед подсчетом клеток. Затравочные клетки в концентрации 15 000 клеток на миллилитр в трех миллилитрах среды для культивирования клеток в шестилуночной тарелке для культивирования клеток. Инкубируйте культуральные пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2, чтобы клетки могли прикрепиться ко дну лунки.
На следующий день обработайте экспериментальные культуры 100 нанограммами на миллилитр актиномицина D, а среду и растворитель контролируют свежей питательной средой и ДМСО соответственно в течение 24 часов. Извлеките среду из лунок и соберите отработанную среду в 15-миллилитровую пробирку. Промойте ячейки 1X PBS.
Добавьте 500 микролитров трипсина, чтобы отделить клетки. Аккуратно нанесите один миллилитр среды на спину два-три раза, чтобы механически вытеснить оставшиеся клетки, все еще прикрепленные ко дну лунки. Добавьте раствор из лунок в 15-миллилитровую пробирку, а затем добавьте пять миллилитров свежей питательной среды для нейтрализации трипсина.
Пипетка 450 микролитров реагента, содержащего ДНК-связывающие красители, в микроцентрифужной пробирке. Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение пяти минут.
Перечислите клетки с помощью проточной цитометрии. Разбавьте все образцы до концентрации от 10 до шестой клетки на миллилитр с питательной средой для клеток, прежде чем приступать к анализам апоптоза. Чтобы обнаружить экстернализацию фосфатидилсерина с помощью аннексина V, добавьте 100 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку.
К этому добавьте 100 микролитров смеси флуоресцентного конъюгированного аннексина V и реагента 7-AAD в соотношении 1:1. Выдерживают при комнатной температуре 20 минут, защищая от света. Для анализа деполяризации митохондриальной мембраны начните с центрифугирования 100 микролитров клеточной суспензии в 300 раз G в течение пяти минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре 1X PBS. Добавьте 100 микролитров окрашивающего раствора TMRE к каждому образцу и перемешайте суспензию путем осторожного обратного пипетирования. Заверните образцы в чистую алюминиевую фольгу, чтобы защитить их от света, и инкубируйте клетки в течение 20 минут в увлажненной среде CO2 при температуре 37 градусов по Цельсию.
По окончании инкубации добавьте в образец рабочий раствор 7-ААД и перемешайте. Чтобы обнаружить активированные концевые каспазы-3 и 7, начните с разбавления DEVE-связанного ДНК-связывающего пептида в ДМСО до соотношения 1:8 стерильным 1X PBS, чтобы сделать обнаружение каспазы рабочим раствором. Хранят раствор на льду или добавляют от двух до восьми градусов Цельсия, в защищенном от света месте.
Добавьте два микролитра исходного раствора 7-AAD к 148 микролитрам 1X PBS, чтобы получить рабочий раствор 7-AAD. Хранят раствор на льду или при температуре от двух до восьми градусов Цельсия, в защищенном от света месте. Центрифугу 50 микролитров клеточной суспензии в течение пяти минут в 300 раз G и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируют клетки в 50 микролитрах 1X PBS, а затем в пяти микролитрах рабочего раствора для обнаружения каспазы и тщательно перемешивают. Ослабьте крышку трубок и инкубируйте в течение 30 минут в увлажненной среде CO2 при температуре 37 градусов Цельсия, защищенной от света. Добавьте 150 микролитров рабочего раствора 7-AAD к каждому образцу и перемешайте.
Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, защищенной от света. Для обнаружения двухцепочечных разрывов ДНК и общего повреждения ДНК сначала центрифугируют 50 микролитров клеточной суспензии в течение пяти минут при 300 перегрузках и отбрасывают надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах 1X PBS, добавьте 500 микролитров фиксирующего буфера на основе формальдегида и перемешайте.
Инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут. Центрифугу в течение пяти минут при 300 перегрузках и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируют клетки в 90 микролитрах 1X PBS в микроцентрифужной пробирке.
Добавьте 10 микролитров раствора антитела в микроцентрифужную пробирку. Инкубировать при комнатной температуре 30 минут в темноте. Добавьте 100 микролитров 1X PBS и центрифугу в течение пяти минут в 300 раз G.Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах 1X PBS.
Перемешайте образец, осторожно запипетывая перед загрузкой образца в проточный цитометр. Проверьте аналитическую производительность проточного цитометра, запустив комплект для проверки системы прибора, и не приступайте к работе с образцами, пока все проверки не будут завершены и пройдены. Сначала загрузите отрицательный контрольный образец в проточный цитометр и выберите «Выполнить», «Отрегулировать настройки», чтобы прибор начал аспирацию образца и обеспечил предварительный просмотр обнаруженных событий в режиме реального времени.
Используя предварительный просмотр в реальном времени, отрегулируйте пороговые значения флуоресценции и размера клеток. Нарисуйте прямоугольные ворота вокруг популяции клеток, перетащите маркер порога, чтобы исключить клеточный мусор, и нажмите кнопку «Далее, установить профиль апоптоза», чтобы продолжить. Коснитесь и перетащите маркеры квадранта, чтобы разделить популяции клеток и отобразить обнаруженные события в режиме реального времени.
Используйте эти графики, чтобы помочь конечному пользователю правильно разместить маркеры квадранта. Нажмите кнопку "Далее", проверьте параметры, чтобы продолжить, чтобы прибор отобразил сводку настроек. Просмотрев параметры, нажмите кнопку "Далее", "Завершить параметры", чтобы применить эти параметры ко всем образцам в эксперименте.
Смешайте первый образец путем осторожного обратного пипетирования и загрузите первый образец в проточный цитометр. Нажмите кнопку "Далее", затем присвойте образцу имя и нажмите кнопку "Выполнить", чтобы система начала выполнение примера. При необходимости выполните тонкую настройку маркеров ворот или квадрантов после сбора.
Найдите эксперимент, который нуждается в настройке, перейдя в системный файловый браузер, и откройте эксперимент. Нажмите на миниатюру предварительного просмотра графика, чтобы увеличить его. Чтобы настроить маркеры квадранта, нажмите на пересечение вертикальных и горизонтальных линий, чтобы переместить маркеры в том виде, в котором они есть, и отрегулируйте угол любой линии, щелкнув линию и перетащив маркер.
Чтобы уточнить стробирование ячеек, нажмите на вкладку «Ворота» и отрегулируйте размеры ворот. Отрегулируйте маркеры по своему усмотрению и примените эти параметры ко всем образцам в эксперименте, щелкнув значок галочки, пометив все образцы и выбрав «Принять». Выполняйте тесты в трех экземплярах и выполняйте дисперсионный анализ с помощью теста Бонферрони post hoc для оценки значительных различий между образцами и контрольной группой.
Результаты подсчета клеток и жизнеспособности показали, что 95,2% клеток в образце были живыми, а 4,8% — мертвыми. Было обнаружено, что концентрация клеток составляет 5,90 умножить на 105 клеток на миллилитр. Анализ аннексина V и клеточной смерти показал значительное увеличение количества апоптотических клеток в клетках SiHa, обработанных актиномицином D в концентрации 100 нанограммов на миллилитр, по сравнению с контрольной группой.
Анализ митохондриального электрохимического трансмембранного потенциала продемонстрировал значительное снижение профилей здоровья клеток между актиномицином-D, контролем среды и контролем растворителя, что позволило предположить, что 100 нанограммов на миллилитр актиномицина D индуцировали митохондриальную деполяризацию в клетках SiHa. Анализ каспазы-3 и 7 продемонстрировал значительную активацию концевых каспаз в клетках SiHa, обработанных актиномицином D в концентрации 100 нанограммов на миллилитр, по сравнению с контрольной группой. Актиномицин D значительно индуцировал маркеры повреждения ДНК, ATM и H2A.
X в клетках SiHa, что свидетельствует о значительном увеличении повреждения ДНК. Чтобы повысить точность, убедитесь, что вы собираете всю популяцию клеток. Кроме того, придерживайтесь рекомендованных производителем концентраций клеток и времени окрашивания.
Защита окрашенных образцов от света позволяет избежать фотообесцвечивания или флуорофоров. Биохимический анализ апоптоза методом проточной цитометрии должен подкрепляться микроскопией. Это позволит выявить морфологические особенности классического апоптоза.
Особенности включают ядерную конденсацию, смешивание клеточных мембран, апоптотические тельца и кариорексис.
