Представленные здесь протоколы были оптимизированы для 3D-культуры и позволяют эффективно и доступно изумить процессы, связанные с ростом раковых клеток, распространением и смертью в 3D-среде. Основными преимуществами использования 3D-культуры является то, что они являются уникальной возможностью для повторения ключевых аспектов микрооквидения опухоли в пробирке. 3D сфероид является важным инструментом для скрининга рака наркотиков, который все чаще используется для улучшения перевода между in vitro и in vivo условиях в исследовании терапии рака.
Некоторые из протоколов требуют определенного количества практики и навыков. Это особенно верно для производства сфероидов методом падения рук, а также для встраивания сфероидов для иммуногистохимии. Поскольку ключевые элементы этих процедур трудно описать в письменной форме, например, как вставить сфероиды в каплю агарозы, визуальная демонстрация поможет исследователям выполнить эти процедуры.
Разбавить подготовленную подвеску клетки в 15 миллилитровой трубке, чтобы получить оптимальную плотность клеток. Перенесите разбавленную клеточную подвеску в стерильный резервуар и используйте многоканальную пипету для распределения 200 микролитров в ранее подготовленную пластину. Инкубация при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом и влажностью 95%.
Каждые два-три дня приобретайте легкие микроскопические изображения сфероидов. После получения изображений удалите из каждой хорошо 100 микролитров отягощенной среды и замените ее 100 микролитров свежей среды. Во-первых, оттепель воссоздал мембрану подвала на льду.
Храните любые индивидуально обернутые пластины и резервуары на льду перед использованием. Затем разбавьте подготовленную подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку, чтобы получить оптимальную плотность клеток. Поместите трубку, содержащую разбавленную подвеску клетки, на лед.
Заполните пластиковые контейнеры со льдом и передать их в капюшон. Перенесите охлажденные пластины и резервуары на капот клеточной культуры. Поместите плиты и резервуары обратно на лед.
Повторное использовать rBM осторожно, чтобы обеспечить однородное гель. Добавьте оптимальную концентрацию ПБМ к охлажденной клеточной подвеске. Переверните трубку, чтобы убедиться, что rBM и подвеска ячейки должным образом смешаны.
Затем перенесите эту смесь в стерильный резервуар и используйте многоканальную пипетку, чтобы раздать по 200 микролитров каждому колодец охлажденной, ультранизкой пластины, 96-колодец. Центрифуга пластины в 750 раз g в течение 15 минут, чтобы убедиться, что клетки сгруппированы вместе, когда RBM затвердевает. Используйте центрифугу мягкого спуска или минимальной тормозной функции.
Во-первых, добавить шесть миллилитров PBS в блюдо клеточной культуры. Разбавить подготовленную подвеску клетки, чтобы получить подходящее разбавление. Практическое разбавление составляет 50 000 клеток на миллилитр.
Налейте подвесную клетку в стерильный резервуар и используйте многоканальный пипетку, чтобы тщательно поместить до 30 капель суспензии в крышку клеточной культуры блюдо, в результате чего концентрация 2000 клеток на каплю. В быстром, но контролируемом движении, инвертировать крышку и поместить его на верхней части клетки культуры блюдо, содержащее PBS. Инкубация при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом и 95%humidity в течение четырех-шести дней.
Если сфероиды должны быть использованы для лизеров белка или встраивания, потяните их, удалив крышку, наклонив ее, а затем смыв капли с одним миллилитром нагретых средств массовой информации. Перенесите полученную сфероидную среду в 1,5 миллилитровую трубку. Пусть сфероид поселиться в нижней части трубки, прежде чем приступить к белка лисаты или встраивания.
Вырежьте конец наконечника пипетки P200, чтобы легче захватить сфероиды, не нарушая их структуру. Для каждого условия, тянуть минимум 12, но в идеале между 18 и 24 сфероидов в 1,5 миллилитровой трубки. Поместите трубки на лед и дайте сфероидам осесть на дне.
Затем перейти из лаборатории стерильных клеток в обычную лабораторию. Вымойте сфероиды дважды в один миллилитр ледяной один X PBS, убедившись, чтобы сфероиды оседают перед удалением PBS между каждым шагом стирки. Затем, аспирировать как можно больше PBS, как это возможно, не нарушая или удаления сфероидов.
Добавьте пять микролитров буфера нагретого лиза с ингибиторами фосфатазы и протеазы на сфероид. Вихрь сфероидов в течение 30 секунд, а затем выполнить быструю центрифугу в течение 10 секунд. Повторите эти интервалы вихрей и центрифугации в течение пяти-десяти минут, или до тех пор, пока сфероиды не растворятся.
После подготовки решения PI, удалить 100 микролитров среды из каждой хорошо в 96-хорошо пластины, убедившись, что не удалить сфероиды. Добавьте 100 микролитров подогревом по одному X PBS к каждой скважине, а затем удалив из скважин 100 микролитров жидкости. Повторите этот шаг стирки три раза, чтобы вымыть все оставшиеся среды.
Затем добавьте 100 микролитров решения PI к каждой колодец. Обложка пластины в алюминиевой фольге и инкубировать на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа и 95% влажности в течение 10 до 15 минут. После этого повторите процесс стирки с подогревом одного X PBS три раза, как описано ранее, чтобы вымыть решение PI и уменьшить фоновый сигнал при визуализации.
Используя эпифлюоресценцию микроскопа, изображение сфероидов. В рамках программного обеспечения для визуализации откройте многокананное меню. Установите время экспозиции для соответствующих каналов и нажмите Настройки чтения после настройки каждого канала.
Откройте меню «Стек» и определите начало и конец, отрегулив фокус изображения. Первоначально есть сфероид из фокуса, а затем переместить координационный центр через весь сфероид, пока изображение становится размытым еще раз. Затем отрегулируйте размер шага на 18-35 микрометров и нажмите Start.
Для начала, исправить сфероиды в дым капот на первый день, как указано в текстовом протоколе. На второй день поместите гель агарозы в заполненный водой стакан в микроволновой печи, чтобы нагреть его и держать гель теплым на скамейке верхней нагревательной пластины установлен на 60 градусов по Цельсию, пока это необходимо. Вымойте сфероиды дважды в капоте дыма, используя один миллилитр ледяной один X PBS за стирку.
Затем, аспирировать большую часть PBS. Подготовь 20 микролитровых пипеток наконечник, разрезая его на наклон, чтобы получить pointier отзыв с большим отверстием. После этого сделайте агарозный гель каплей на слайде микроскопа.
Поместите горку на теплый нагревательный блок, чтобы предотвратить затвердевание агарозы. Используя модифицированный наконечник пипетки, поймать как можно больше сфероидов, как это возможно в объеме от 15 до 20 микролитров. Тщательно ввимите сфероиды в центр капли геля агарозы, убедившись, что не прикасайтесь к слайду микроскопа.
Инкубировать при комнатной температуре или при четырех градусах в течение пяти-десяти минут, чтобы агарозный гель упал затвердеть. Когда капля геля несколько затвердела, но все еще довольно мягкая, используйте скальпель, чтобы тщательно подтолкнуть его от микроскопа слайд в пластиковой кассете ткани. Перенесите тканевую кассету в стакан, наполненный этанолом, и храните при комнатной температуре.
В этом исследовании представлен ряд методов для анализа противоораком лечения индуцированных изменений в жизнеспособности раковых клеток и смерти в 3D-культуре. Концентрация добавленных rBM может глубоко повлиять на морфологию сфероидов. Добавление до 2,5%rBM позволяет образование сфероидов в SKBr-3 раковых клеток молочной железы, без дальнейшего эффекта при более высоких концентрациях.
В отличие от этого, BxPC-3 раковые клетки поджелудочной железы спонтанно образуют небольшие компактные сфероиды. В этом типе клеток, увеличение RBM до 1,5% или выше вызывает различные морфологические изменения от сфероидов к более запутанным структур с выступами и invaginations. Здесь показан пример использования сфероидных культур для скрининга эффективности химиотерапии.
Световые изображения микроскопа приобретаются каждые два-три дня во время эксперимента по ответу на дозу, выполненного для определения дозы, необходимой для 50%-ной жизнеспособности в клетках рака молочной железы MDA-MB-231. Пространственное расположение мертвых клеток при повышении концентрации ингибитора можно визуализировать с помощью Окрашивания ИП. Как видно, сфероиды управления показывают ограниченное некротическое, позднее апоптотическое ядро, в то время как мертвые клетки распределены по всему сфероиду по мере увеличения концентрации ингибитора.
Показанная здесь техника сфероидов может быть применена ко многим другим анализам, таким как 3D-вторжение, миграция или микрофоретический анализ. Это также применимо для совместно культур с фибробластом, адипоцитами или иммунными клетками, которые могут предоставить важную информацию о клеточных взаимодействиях в микроокноронии опухоли. Разработка этого метода была очень важна в выяснении роли микроокноронности опухоли во многих аспектах развития рака, включая экспрессию генов, вторжение и помощь в лечении.
