Протокол, описанный здесь, подходит для оценки эффективности трансгенных комаров и сравнения с аналогами дикого типа в небольших лабораторных испытаниях в клетке. Испытания в небольших клетках имеют важное значение для получения эмпирических ценностей, которые помогут внедрить новые технологии элиминации малярии. Испытания в клетке могут быть адаптированы к другим экспериментальным проектам и подходят для оценки динамики угрозы трансгена желания.
После интродукции трансгенные особи. Начните начальную фазу эксперимента с установки трех клеток по 0,216 кубических метра в трех экземплярах. И добавление 60 личинок дикого типа в каждую клетку в течение трех последовательных недель.
Каждую неделю обеспечьте взрослых самок в каждой клетке обезболенных мышей в качестве источника кровяной муки. И контейнер для яйцекладки через три дня после приема пищи с кровью. Высиживают яйца из каждой клетки еженедельно.
С четвертой по восьмую неделю выберите 60 личинок L2 второго звезды случайным образом, чтобы вернуться в свои соответствующие клетки. На девятой неделе случайным образом назначьте один набор тройных клеток в качестве контрольных элементов и один набор для каждого желаемого коэффициента высвобождения. Добавляйте 60 куколок дикого типа с 30 самцами и 30 самками в контрольные клетки еженедельно.
Поддерживайте соотношение один к одному в каждой соответствующей клетке, еженедельно добавляя 30 трансгенных самцов куколок вместе с 60 куколками дикого типа. Для соотношения один к 0,1 добавьте 300 трансгенных мужских куколок еженедельно в каждую соответствующую клетку вместе с 60 куколками дикого типа. Повторяйте добавление куколок комаров в клетку, обеспечивая кровавую муку и инкубационные яйца каждую неделю.
Выберите в общей сложности 300 личинок из каждой клетки случайным образом для скрининга. Экранирование личинок под стереомикроскопом с флуоресцентными фильтрами для экспрессии флуоресцентного доминантного маркера на личиночной и куколочной стадиях. Оцените пол полученных куколок.
В эксперименте по генному драйву используйте барьерную стратегию, удерживая комаров в безопасном инсектарии и следуя стандартным операционным процедурам с регулярным мониторингом. Подготовьте клетку, установленную с двумя наборами тройных клеток по 0,216 кубических метра для каждого желаемого трансгенного и дикого типа мужского высвобождения. Чтобы достичь соотношения высвобождения самцов один к одному, добавьте 120 трансгенных самцов, 120 самцов дикого типа и самок на стадии куколки к каждой реплицированной клетке.
Обеспечьте кровавую пищу с помощью анестезированных мышей четырех-семидневным самкам в каждой клетке. После инкубации яиц в личиночном лотке выберите примерно 240 первых личинок L1 случайным образом из каждой клетки и вырастите их до куколок, прежде чем вернуться в соответствующие клетки. Выберите и отсейте личинок на наличие глазного маркера и фенотипа пола, как описано выше.
Соберите клеточную установку из тройных клеток объемом 0,005 кубических метра с равным количеством самцов и самок для каждого конкретного соотношения высвобождения трансгенных и диких самцов. Используя аппарат искусственного питания, обеспечьте кровяную пищу четырех-семидневным самкам в каждой клетке в течение двух последовательных дней. Через три дня после второго приема пищи добавьте контейнер для яйцекладки и удалите контейнеры через три дня.
После подсчета всех мертвых и живых взрослых особей, оставшихся в клетке по полу, храните их при минус 80 градусах Цельсия для молекулярного анализа. Высиживают яйца и запускают отбор 200 личинок L1 и откладывают личинок в сторону, чтобы заселить новые клетки для следующего поколения. Затем случайным образом выберите еще 500 личинок из каждой клетки, отведенной для скрининга.
Вырастите отобранные 200 личинок до куколки и 500 личинок до стадии L4 instar. Верните куколку из 200 лотков для заселения новой клетки. Скрининг случайно выбранных личинок на маркер глаза и фенотип пола Как и раньше.
В репрезентативном анализе показана ожидаемая динамика фенотипов наиболее эффективных реплик для различных протоколов испытаний популяционной замещающей клетки. Результаты показали линейное увеличение доли личинок с фенотипом маркера DsRed в течение семи поколений. Выпуск один к одному без привода достиг чуть более 80% внедрения трансгена в течение семи поколений.
Протоколы генного драйва достигли этого в течение трех-четырех поколений. Таким образом, подтверждение того, что однократное высвобождение системы генного драйва может быть более эффективным для внедрения трансгенов. В конце наблюдения распространение трансгена достигло почти полного внедрения в системы генного драйва.
Важные параметры, такие как коэффициент высвобождения популяции, возрастная структура, размер клетки и другие, будут варьироваться в зависимости от цели эксперимента и конкретных целей. Эксперименты для оценки параметров приспособленности, таких как фертильность и плодовитость, могут быть проведены. Дальнейшие эмпирические данные испытаний в клетке могут быть использованы для параметризации математических моделей динамики популяции.
