Этот протокол поддерживает характеристику роли генов комаров, участвующих в различных физиологических путях, включая, например, устойчивость насекомых и развитие малярийных паразитов. Метод управляет вставкой трансгенов в отдельные предварительно охарактеризованные геномные местоположения и, следовательно, позволяет напрямую сравнивать фенотипы, полученные из альтернативных трансгенов, эффективно избегая проблемы позиционного эффекта. Этот метод может быть применен к различным видам насекомых, имеющим значение для общественного здравоохранения и сельского хозяйства, и его применение широко распространяется от бактерий до клеток млекопитающих.
Начните с проектирования донорских плазмид attB, несущих доминирующий флуоресцентный маркер, участки рекомбинации attB и желаемый трансгенный груз. Используйте один сайт attB для интеграции всей плазмиды, несущей трансгенную кассету, или двух перевернутых сайтов attB для кассетного обмена. Очистите донорские и вспомогательные плазмиды с помощью набора для очистки без эндотоксинов.
Объедините помеченную attB донорскую плазмиду, несущую интересующий трансген, и вспомогательную плазмиду, несущую интегразу, чтобы получить смесь с конечной концентрацией 350 нанограмм на микролитр донорской плазмиды и 150 нанограммов на микролитр плазмиды-помощника. Осаждение ДНК путем добавления 0,1 объема трех молярных ацетатов натрия и 2,5 объемов ледяного холодного 100% этанола, затем вихрь. Белый осадок должен быть сразу виден.
Вымойте гранулу и повторно суспендируйте ее в буфере для инъекций, чтобы достичь общей конечной концентрации 500 нанограмм на микролитр. Затем подготовьте аликвоты по 10-15 микролитров в каждой и храните их при отрицательных 20 градусах Цельсия. Кровь питает четырех-семидневных комаров из нужной стыковочной линии и их собратьев дикого типа за 72 часа до микроинъекции.
Выполняйте микроинъекции эмбриона Anopheles gambiae в 25 миллимоляров хлорида натрия, нацеливаясь на задний полюс эмбриона под углом 45 градусов. Выполняйте микроинъекции эмбриона Anopheles stephensi в галогенуглеродном масле, нацеливаясь на задний полюс под углом 30 градусов. Сразу после инъекции переложите яйца в чашку Петри, наполненную стерильной дистиллированной водой, и верните их в инсектарные условия.
После вылупления ежедневно перекладывайте личинку G0 в лоток с подсоленной дистиллированной водой и задним ходом к куколкам. Сортируйте куколок G0 по полу под стереоскопом. Позвольте самцам появиться в отдельных клетках в группах от трех до пяти человек и добавьте десятикратное превышение по возрасту самок дикого типа.
Позвольте самкам появиться в отдельных клетках в группах от 10 до 15 человек и добавьте равное количество самцов дикого типа. Позвольте взрослым спариваться в течение четырех-пяти дней и обеспечьте самок кровяной пищей. Собирайте яйца и выращивайте G1 следующего поколения.
Соберите личинки G1, L3 и L4 в чашке Петри, выстланной влажной фильтровальной бумагой, или на слайде микроскопа и просейте их с помощью флуоресцентного стереоскопа на наличие маркера, введенного с грузом с меткой attB. Для конструкций с одним attB экран для наличия нового и уже существующего маркера. Для двойных attB конструкций для кассетного обмена, экрана для наличия нового маркера и потери ранее существовавшего.
Сортируйте преобразованных куколок G1 по полу и массово скрещивайте их с разнополыми по возрасту особями дикого типа. Позвольте взрослым спариваться в течение четырех-пяти дней и обеспечьте кровяную пищу. Для одиночных интеграционных экспериментов собирайте яйца непосредственно из массового креста.
Для экспериментов по кассетному обмену собирайте яйца у одиночных самок и поддерживайте потомство отдельно до тех пор, пока молекулярная оценка не будет завершена из-за потенциального присутствия двух альтернативных ориентаций кассет. Скрининг потомства G2 на наличие флуоресцентного маркера и выделение подмножества G2-положительных людей для молекулярного анализа. Доведите остальных до зрелого возраста.
Выполнить молекулярную валидацию сайтов введения с помощью ПЦР, как описано в текстовой рукописи. Для одиночной интеграции убедитесь, что прогнозируемый сайт вставки несет исходную конструкцию стыковки, а также всю последовательность донорской плазмиды между двумя гибридными сайтами attL и attR. Для обмена кассетами убедитесь, что прогнозируемый сайт вставки идентичен сайту стыковочной линии, где гибридные инвертированные сайты attL заменяют исходные инвертированные сайты ATTP, а шаблон обмена заменяет кассету, первоначально присутствующую между ними.
Протокол использовался для генерации стабильной трансгенной линии Anopheles примерно через 10 недель. Фенотипическая валидация трансформации проводилась путем скрининга на флуоресцентные маркеры, регулируемые промотором 3xP3, показаны здесь. Новая линия Anopheles stephensi была получена путем вставки кассеты с красной маркировкой DS в стыковочную линию, помеченную CFP, в результате чего потомство G1 выражало оба маркера, о чем свидетельствует красная и синяя флуоресценция в глазах.
Кассетные обменные конструкции приводят к замене маркера, первоначально вставленного в стыковочную линию, маркером донорской плазмиды. Этот обмен маркерами был продемонстрирован в стыковочной линии Anopheles gambiae, где маркер CFP был потерян, а маркер YFP приобрел, что привело к флуоресценции желтого глаза и нервного канатика. Иногда RMCE может привести к одному событию интеграции вместо обмена желаемой трансгенной кассетой, где личинка помечена как исходным CFP, так и новыми маркерами YFP.
При скрининге на наличие флуоресцентного маркера крайне важно отличить его сигнал от возможной фоновой автофлуоресценции. Увеличение увеличения и сосредоточение внимания на тканях и органах, где флуоресценция, как ожидается, будет управляться промотором, необходимы для выявления истинных CFP-положительных людей. Отдельные трансформанты также оценивались молекулярно с помощью ПЦР для подтверждения ожидаемого места введения.
Валидация ПЦР у лиц из обменной линии Anopheles gambiae показана здесь. Даже соответствующая техника микроинъекций, точный дизайн и подготовка донорских и вспомогательных плазмид, а также следование соответствующей схеме разведения комаров являются ключевыми для получения трансгенных особей. Эта процедура может быть использована для вставки элементов, вызывающих чрезмерную экспрессию генов или заглушение, например, системы GAL4 / UAS, а также элементов генного драйва и молекул антипатогенов для генетического контроля комаров.
