Культуру органов типа Троуэлла используют для культивирования тканевых эксплантов. Здесь мы покажем, как использовать этот метод для изучения стволовых клеток в непрерывно растущих зубах. С помощью этой методики мы можем изучать стволовые клетки и их поведение в нише и экранировать влияние различных молекул на выживание и поддержание стволовых клеток.
Этот метод может быть применен для изучения стволовых клеток других органов, таких как кожа или молочная железа. Начните с размещения 30-миллиметровых металлических сеток с отверстиями диаметром от одного до двух миллиметров в 35-миллиметровую чашку Петри. Заполните место носителем до тех пор, пока носитель не достигнет поверхности сетки.
Затем инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия, пока ткань не будет изолирована и готова к культивированию. После обезглавливания мыши удалите кожу, чтобы обнажить нижнюю челюсть, и прорежьте мышцы массажиста, чтобы отделить нижнюю челюсть от верхней челюсти и остальной части головы. Как только нижняя челюсть будет изолирована, удалите язык и максимально мягкие ткани.
Разделите нижнюю челюсть по средней линии, разрезав симфиз. Поместите нижнюю челюсть в чашку Петри, содержащую PBS на льду. Используйте одноразовую иглу для подкожных инъекций 20 на 26 калибр для рассечения резца.
Затем очистите мягкие ткани и мышечную ткань от поверхности кости для лучшей визуализации. Для нижней челюсти, полученной от животных моложе 10 дней, используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20 на 26 калибров, чтобы открыть каждую половину нижней челюсти продольно, чтобы обнажить резцовый зуб. Аккуратно отсоедините резец от окружающей кости.
Отрежьте проксимальный конец, который содержит шейную петлю, и удалите минерализованную эмаль и дентиновый матрикс. Храните собранные проксимальные концы в PBS Дульбекко на льду до тех пор, пока они не будут готовы к культивированию. Для мышей старше 10 дней открывайте каждую половину нижней челюсти продольно, чтобы обнажить резцовый зуб.
Используйте пинцет, чтобы захватить нижнюю челюсть и сломать кость, чтобы обнажить зуб. Отрежьте проксимальный конец, который содержит шейную петлю. Храните собранные проксимальные концы в PBS Дульбекко на льду до тех пор, пока они не будут готовы к культивированию.
Аккуратно поместите прямоугольные фильтры поверх сетки в предварительно подогретую культуральную посуду и правильно сориентируйте кусочки ткани. Инкубируйте плиту при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности от 90 до 95%. Тщательно меняйте среду на чередующиеся дни, избегая образования пузырьков воздуха.
Следите за ростом тканей и ежедневно захватывайте изображения. Выньте питательную среду из посуды и аккуратно добавьте в ткань ледяной метанол. Затем высиживают его в течение пяти минут.
Перенесите фильтр, несущий тканевый эксплант, в пробоотборную трубку, заполненную фиксирующим раствором. Зафиксируйте эксплант в 4%-ном параформальдегиде, приготовленном в PBS, максимум на ночь при четырех градусах Цельсия. Эпителиальные стволовые клетки находятся в нише, называемой шейной петлей, расположенной на проксимальном конце резца.
Шейная петля содержит внутренний и наружный эпителий эмали, который заключает в себе звездчатый ретикулум, ядро слабо расположенных эпителиальных клеток. Каждый резец имеет одну лабиальную и одну лингвальную цервикальную петлю, но только лабиальная шейная петля содержит стволовые клетки. Проксимальный конец резца, выделенный у двухдневных постнатальных мышей Sox2-GFP, был захвачен, что позволило идентифицировать и визуализировать эпителиальные стволовые клетки Sox2-экспрессирующего резца.
В шейных петлях, выделенных у красных трансгенных мышей Sox2-GFP и Fucci, были идентифицированы GFP-положительные стволовые клетки и Fucci-красные-положительные непролиферативные клетки. Экспрессия Sox2-GFP использовалась в качестве репортера для анализа влияния сигнального активатора Wnt/бета-катенина BIO, который негативно повлиял на стволовые клетки, экспрессирующие Sox2, а также на экспрессию GFP. Этот метод может быть оптимизирован для визуализации поведения стволовых клеток в реальном времени.
Прессованные или культивируемые экспланты также могут быть ферментативно обработаны до одноклеточных суспензий для дальнейшего анализа.
