Сигнальные пути, управляющие многоклеточными системами, динамичны. Чтобы понять функцию этой динамики, важно иметь возможность тонко модулировать эту динамику, не влияя на общую сигнальную активность. Этот протокол использует микрофлюидную систему, которая позволяет функционально рассеивать сигнальные колебания у развивающихся эмбрионов мышей.
Динамика передачи сигналов была обнаружена во многих тканях, включая взрослые. Микрофлюидика является универсальным инструментом, который может быть адаптирован для многих модельных систем, включая клеточные, тканевые и органоидные культуры. Для начала приготовьте необходимое количество PDMS путем смешивания мономера с катализатором в соотношении девять к одному для индуцирования полимеризации.
Используйте одноразовые инструменты и убедитесь, что смешивание выполнено правильно. Поместите смесь PDMS в осушитель и нанесите вакуум примерно на 30 минут, чтобы удалить воздух. Залейте слой PDMS размером примерно от трех до пяти миллиметров в форму чипа и поместите обратно в осушитель примерно на 30 минут.
Отверните форму, поместив ее в духовку на ночь при температуре 65 градусов Цельсия или ниже в зависимости от материала формы. Вырежьте чип из формы с помощью скальпеля. Пробивайте входные и выпускные отверстия с помощью одномиллиметрового биопсийного перфоратора, начиная с внутренней стороны микрофлюидной камеры.
Очистите стеклянную горку сжатым воздухом. Чтобы прикрепить чип к стеклянному слайду, поместите чип и стеклянный слайд в плазменную печь с помощью сторон, которые должны быть склеены вверх. Генерируйте плазму, используя протокол, специфичный для используемой машины, затем привязывайте чип к стеклу, помещая активированные поверхности друг на друга и равномерно применяя давление.
Чтобы подготовить трубку и чип для эксперимента, разрежьте трубку под углом 45 градусов и прикрепите по одной игле к каждой из трубок. Поместите трубку с иглами, чипом и пробками в чашку и стерилизуйте их, подвергая воздействию ультрафиолета в течение примерно 15 минут. Чтобы покрыть чип фибронектином, поместите чип в стакан, содержащий PBS плюс 1% пенициллина или стрептомицина при комнатной температуре.
Промывайте чип PBS, чтобы удалить воздух с помощью пипетки P200. Загрузите трехмиллилитровой шприц для каждой камеры чипа. Прикрепите иглу к шприцу, содержащему фибронектин, и подключите шприц к шприцевому насосу.
Промывайте трубку вручную для удаления воздуха. Прикрепите выпускную трубку к выходному отверстию чипа. Обязательно отодвиньте трубку до самого низа и установите низкий расход, чтобы покрыть чип.
Дайте шприцевому насосу работать не менее двух часов или на ночь. Когда закончите, остановите насос и отрежьте трубку сразу после иглы. Подготовьте шприцы, наполненные средой для эксперимента, и дегазируйте как культуральную среду, так и стружку в PBS.
Попробуйте смыть или высосать большую часть пузырьков воздуха из чипа, затем установите шприцы в насосы и прикрепите впускную трубку к шприцам. Чтобы загрузить ткань на чип, рассекните самый задний кончик хвоста. Промыть чип питательной средой с 25 микромолярной HEPES для удаления PBS.
Загрузите ткань в чип с помощью пипетки P200. После каждого этапа загрузки ткани закройте соответствующее входное отверстие для загрузки тканей, используя кусок заполненной PDMS трубки. Чтобы собрать микрофлюидную установку, прикрепите трубку к микрофлюидному чипу, не получая пузырьков воздуха внутри.
Для этого убедитесь, что в конце трубки присутствует капля среды. Как только вся трубка будет прикреплена к чипсу, выньте ее из стакана и поместите в чашку, содержащую влажную ткань. Поместите блюдо и примерно 1,5 метра входной трубки в инкубатор для ночного культивирования.
Обеспечьте высокую влажность, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время культивирования. Альтернативно, высушите внешнюю часть чипа и поместите его в держатель микроскопа, затем поместите держатель и примерно 1,5 метра входной трубки внутрь инкубационной камеры инвертированного микроскопа для эксперимента с визуализацией в реальном времени. По крайней мере, через 20 минут постоянного потока начинайте запланированную для эксперимента откачку.
Чтобы увлечь выемку сигналов в сегментирующем эмбрионе мыши, используйте программу накачки из 100 минут среднего и 30-минутного импульсов препарата, повторяемых до конца эксперимента, обычно в течение 24 часов. Для визуализации в режиме реального времени начните обработку изображений по крайней мере через 30 минут. Чтобы подтвердить унос сигнальных колебаний, несколько экспериментов выравнивают с использованием времени пульсов препарата и визуализируют с помощью красителя Cascade Blue.
Количественные колебания могут быть детрендированы и отображены как среднее, а стандартное отклонение или фазы колебаний могут быть рассчитаны. Может быть проанализирована фазовая зависимость между колебаниями независимых задних эмбриональных культур друг к другу и к внешним лекарственным импульсам. Чтобы подтвердить увлечение, можно, например, определить период эндогенных сигнальных колебаний с помощью программы pyBOAT на основе Python.
При применении импульсов с периодом 130 минут, сигнальные колебания насечки также показывают период в 130 минут. Крайне важно предотвратить испарение жидкости во время микрофлюидного эксперимента. В противном случае в чипе будут образовываться пузырьки воздуха, которые мешают потоку среды.
Чтобы предотвратить это, дегазируйте среду и чип и убедитесь, что влажность в инкубаторе достаточно высока. Используя этот метод, динамика сигнализации может быть модулирована, и их эффекты могут быть проанализированы с помощью визуализации в режиме реального времени флуоресцентных репортеров, иммуноокрашений или гибридизации in situ. Кроме того, ткань также может быть извлечена из чипа для дальнейшего анализа.
Этот метод можно использовать для изучения функции сигнальных колебаний в эмбриональном развитии. Он был применен, чтобы продемонстрировать важность фазового сдвига между двумя колеблющимися сигнальными путями для сегментации эмбриона мыши. В более общем плане, теперь его можно использовать для анализа механизма динамического кодирования сигналов в многоклеточных системах.
