מסלולי איתות השולטים במערכות רב-תאיות הם דינמיים. כדי להבין את הפונקציה של דינמיקה זו, זה חיוני כדי להיות מסוגל לווסת בעדינות דינמיקה זו מבלי להשפיע על פעילות איתות הכוללת. פרוטוקול זה משתמש במערכת מיקרופלואידית המאפשרת ניתוח פונקציונלי של תנודות איתות בפיתוח עוברי עכבר.
דינמיקת איתות נמצאה ברקמות רבות, כולל אלה של מבוגרים. Microfluidics הוא כלי רב-תכליתי שניתן להתאים למערכות מודל רבות, כולל תרבויות תאים, רקמות ואורגנוידים. כדי להתחיל, להכין את הכמות הנדרשת של PDMS על ידי ערבוב מונומר עם הזרז ביחס תשע לאחד כדי לגרום פילמור.
השתמש בכלים חד פעמיים וודא כי ערבוב מושגת כראוי. מניחים את תערובת PDMS במייבש ומניחים ואקום במשך כ -30 דקות כדי להסיר אוויר. יוצקים שכבת PDMS של כשלושה עד חמישה מילימטרים לתוך תבנית השבב ומחזירים למייבש במשך כ -30 דקות.
לרפא את התבנית על ידי הצבתו בתנור לילה ב 65 מעלות צלזיוס או נמוך יותר בהתאם לחומר עובש. חותכים את השבב מהתבנית באמצעות אזמל. חורי מפרצון ושקע אגרוף עם אגרוף ביופסיה מילימטר אחד החל מבפנים של התא microfluidic.
נקו את מגלשת הזכוכית עם אוויר דחוס. כדי לחבר את השבב למגלשת הזכוכית, מניחים את שקופית השבב והזכוכית לתנור הפלזמה עם הצדדים להיות מלוכדים כלפי מעלה. צור פלזמה באמצעות הפרוטוקול הספציפי למכונה המשומשת, ולאחר מכן קשר את השבב לזכוכית על ידי הצבת המשטחים הפעילים אחד על השני והפעלת לחץ באופן שווה.
כדי להכין את הצינורות ואת השבב לניסוי, לחתוך את הצינורות בזווית של 45 מעלות ולחבר מחט אחת לכל אחד הצינורות. מניחים את הצינורות עם מחטים, השבב, ואת התקעים בצלחת לחטא אותם על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול במשך כ 15 דקות. כדי לצפות את השבב עם פיברונקטין, מניחים את השבב בכוס המכילה PBS בתוספת 1% פניצילין או סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר.
יש לשטוף את השבב עם PBS כדי להסיר אוויר עם פיפטה P200. טען מזרק 3 מיליליטר לכל תא של השבב. חבר את המחט למזרק המכיל פיברונקטין וחבר את המזרק למשאבת המזרק.
יש לשטוף צינורות באופן ידני כדי להסיר אוויר. חבר את צינורות השקע לשקע של השבב. הקפד לדחוף את הצינורות כל הדרך לתחתית ולקבוע קצב זרימה נמוך כדי לצפות את השבב.
תן למשאבת המזרק לפעול לפחות שעתיים או לילה. בסיום, עצרו את המשאבה וחתכו את הצינורות מיד לאחר המחט. הכן מזרקים מלאים במדיום לניסוי ודגים הן את מדיום התרבות והן את השבב בתוך PBS.
נסה לשטוף החוצה או למצוץ את רוב בועות האוויר מהשבב, ולאחר מכן להתקין מזרקים במשאבות ולחבר צינורות מפרצון למזרקים. כדי לטעון רקמות על השבב, לנתח את הקצה האחורי ביותר של הזנב. לשטוף את השבב עם מדיום תרבות עם 25 HEPES micromolar כדי להסיר את PBS.
טען את הרקמה לתוך השבב באמצעות פיפטה P200. לאחר כל שלב טעינת רקמות, סגור את הכניסה המתאימה לטעינת רקמות באמצעות חתיכת צינורות מלאים PDMS. כדי להרכיב את ההתקנה המיקרופלואידית, חברו צינורות לשבב המיקרופלואידי מבלי להכניס פנימה בועות אוויר.
כדי לעשות זאת, ודא כי יש טיפה של נוכח בינוני בסוף הצינורות. לאחר שכל הצינורות מחוברים לשבב, מוציאים אותו מהכוס ומניחים אותו בצלחת המכילה רקמה רטובה. שים את המנה וכ 1.5 מטר של צינורות מפרצון באינקובטור לתרבות לילה.
להבטיח לחות גבוהה כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך התרבות. לחלופין, לייבש את החלק החיצוני של השבב ולהניח אותו במחזיק מיקרוסקופ, ולאחר מכן לשים את המחזיק כ 1.5 מטר של צינורות מפרצון בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ הפוך לניסוי הדמיה חי. לאחר לפחות 20 דקות של זרימה מתמדת, התחל את השאיבה המתוכננת לניסוי.
כדי לאמן איתות חריץ בעובר העכבר פילוח, להשתמש בתוכנית שאיבה של 100 דקות בינוני ו 30 דקות פולסים סמים חוזרים על עצמו עד סוף הניסוי, בדרך כלל במשך 24 שעות. להדמיה בזמן אמת, התחילו בהדמיה לאחר 30 דקות לפחות. כדי לאשר אימון של תנודות איתות, ניסויים מרובים מיושרים באמצעות התזמון של פולסים התרופה ודמיינו עם צבע כחול מפל.
תנודות מכמתות ניתן לבטל ולהציג כממוצע סטיות תקן או שלבים של התנודות ניתן לחשב. ניתן לנתח את הקשר הפאזה בין תנודות של תרבויות עובריות אחוריות עצמאיות זו לזו ולפולסות התרופה החיצוניות. כדי לאשר אימון, אפשר למשל לקבוע את התקופה של תנודות איתות אנדוגני באמצעות pyBOAT תוכנית המבוססת על פייתון.
בעת החלת פולסים עם פרק זמן של 130 דקות, תנודות איתות חריץ גם להראות תקופה של 130 דקות. זה קריטי כדי למנוע את אידוי של נוזל במהלך הניסוי microfluidic. אחרת, בועות אוויר ייווצרו בשבב שמפריעות לזרימה בינונית.
כדי למנוע זאת, degas המדיום ואת השבב ולוודא כי הלחות באינקובטור הוא גבוה מספיק. באמצעות שיטה זו, דינמיקת איתות ניתן לאפות וניתן לנתח את השפעותיהם על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים פלואורסצנטיים, חיסונים, או בהכלאה במקום. יתר על כן, ניתן גם לחלץ את הרקמה מהשבב לניתוח נוסף.
אפשר להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הפונקציה של איתות תנודות בהתפתחות עוברית. זה הוחל כדי להדגים את החשיבות של המעבר פאזה בין שני נתיבי איתות מתנדנד עבור פילוח של עובר העכבר. באופן כללי יותר, כעת ניתן להשתמש בו כדי לנתח את המנגנון של קידוד איתות דינמי במערכות רב-תאיות.
