Определение общего количества липидов и классов липидов в морских образцах

Методы, описанные здесь, относятся к соединениям, которые могут быть функционально определены как морские липиды. В основе этого определения положена их поддающаяся жидкостно-жидкостной экстракции в неполярных органических растворителях, что обеспечивает удобное средство отделения их от других соединений в водной матрице. Их гидрофобная природа облегчает их изоляцию от морской воды или биологических образцов, а также их обогащение и удаление солей и белков.

Для проб морской воды первый этап обычно включает разделение на функционально определенные растворенные и твердые фракции, обычно путем фильтрации. Фракция твердых частиц удерживается фильтрами, а размер пор важен для определения отсечки. Используя липидно-чистые щипцы, поместите 47-миллиметровый фильтр из стекловолокна, который был озолен, на систему фильтрации, очищенную от липидов.

Возьмите образец и осторожно покрутите его, чтобы повторно суспендировать любые частицы, которые могли осесть. Отмерьте известный объем. Объем будет зависеть от количества твердых частиц в образце.

Когда объем будет измерен, добавьте всасывание в систему фильтрации и осторожно смочите фильтр отфильтроированной морской водой. Медленно добавьте весь образец в фильтровальную воронку и промойте градуированный цилиндр морской водой, чтобы убедиться, что все частицы добавлены в фильтр. Промывайте воронку аппарата, чтобы убедиться, что все частицы смываются на фильтр.

Протяните всю жидкость через фильтр, но не дайте фильтру высохнуть, так как он может разорвать ячейки, которые находятся на фильтре. Возьмите липидно-чистые щипцы, сложите фильтр пополам, затем снова сложите его на трети, а затем пополам вдоль. Затем фильтр помещается в липидно-чистый флакон.

Накройте фильтр двумя мл хлороформа, процежните крышкой под азотом и запечатайте тефлоновой лентой. На этом этапе образец будет стабильно храниться при минус 20 градусах Цельсия в течение года. Подготовка образца.

Измерьте известный объем фильтрата в липидно-чистом стеклянном градуированном цилиндре. Поместите образец в чистую от липидов сепараторную воронку и добавьте примерно 20 мл хлороформа. Встряхивайте эту смесь не менее двух минут, часто вентилируя.

После первого разделения, удаления первого экстракта и добавления кислоты. После встряхивания раствора в течение двух минут заверните воронку в алюминиевую фольгу и дождитесь отделения, примерно пять минут. Дождавшись разделения, отклеить дно алюминиевой фольги, чтобы увидеть два слоя.

Соберите нижний слой в чистую от липидов колбу с круглым дном, стараясь не включать верхний слой. Колбу с круглым дном заглушат под азотом и поместите в морозильную камеру. Извлеките сепараторную воронку и добавьте в жидкость серную кислоту.

Добавьте 0,25 мл на каждый литр присутствующей морской воды. После того, как серная кислота была добавлена, аккуратно встряхните морскую воду, затем добавьте еще 10 мл хлороформа и энергично встряхните во время проветривания в течение еще двух минут. Затем разрешите разделение.

Второе и третье разделение. Добавьте нижний слой в круглую нижнюю колбу снова, не включая воду. Добавьте третье количество 10 мл хлороформа и встряхните еще две минуты с проветриваниями.

После разделения поместите конечную порцию хлороформа в ту же колбу, и объединенные экстракты могут быть выпарены роторным испарителем и перенесены во флакон объемом два мл. Настройка. Для настройки экстракции вам понадобится изолированный контейнер, наполненный льдом. Растворители включают хлороформ, хлороформ-экстрагированную воду и хлороформ-метанол 2:1.

Из этого раствора вам понадобится примерно один мл на образец, поэтому составляйте его соответствующим образом. Все эти растворители должны быть помещены на лед, чтобы они были холодными к моменту начала экстракции. Образцы также идут по льду, чтобы все оставалось холодным.

Измельчение и экстракция. Образцы хранились замороженными в двух мл хлороформа, поэтому добавьте один мл ледяного метанола или половину пипетки. Будьте осторожны при добавлении метанола, чтобы не коснуться флакона с пипеткой.

Очищают и гомогенизируют три раза метанолом и три раза хлороформом. При измельчении будьте осторожны, чтобы не разрезать флакон для экстракции в руке, если вы сломаете флакон и не нагревать образец. Быстро измельчайте.

После того, как образец будет полностью измельчен, положите его во льд и промойте все оставшиеся частицы из измельчителя обратно во флакон, используя мл хлороформа-метанола 2:1. При необходимости используйте чистый набор щипцов, чтобы заставить частицы вернуться во флакон перед промывкой. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться пипеткой к шлифовальной машине или шлифовальной машиной к флакону.

Затем добавьте 0,5 мл или четверть пипетки хлороформной воды, не прикасаясь к измельчительной машине или измельчительной машине во флакон. Когда шлифовальная машина будет вымыта, прикоснитесь к капле, свисающей с шлифовальной машины, к флакону. Колпачок и держите его во льду до готовности к узвуку.

Двойная пипетка. После центрифугирования во флаконе будет два слоя: органический и водный. Для получения органического слоя используется метод двойного пипетирования.

Для этого между указательным и средним пальцами захватывается короткая пятисантиметровая пипетка с наложенной на него колбой. Осторожно протолкнуть пипетку вниз через два слоя, сжимая луковицу, заставляя пузырьки выходить наружу. Когда нижняя часть второго слоя достигнута, используйте большой палец, чтобы оттолкнуть колбу, не втягивая органический слой в пипетку.

Девятисантиметровой пипеткой сжмите луковицу полностью. Поместите длинный конец пипетки в пятисантиметровую пипетку и снимите нижний слой через пятисантиметровую пипетку. Затем этот экстракт помещается в липидно-чистый флакон.

Продолжайте снимать нижний слой, пока он не будет полностью удален. Все слои объединены в липидно-чистый флакон. Промывка пипеток.

Снимите луковицу с девятисантиметровой пипетки. Поместите его во флакон с экстрактом в нем. Возьмите пипетку чистого хлороформа и, не прикасаясь пипеткой к промываемой, брызните хлороформом вокруг внутренней части пипетки.

Осторожно поверните эту пипетку во время стирки. Возьмите вторую пипетку хлороформа и проделайте то же самое с внешней стороной пипетки. Убедитесь, что весь хлороформ стекает по пипетку и попадает в экстракционный флакон.

Закончив с длинной пипеткой, возьмите короткую и повторите, но вымойте ее во флакон с образцом. Обнаружение образца. Очистите шприц хлороформом.

Возьмите образец известного объема и промойте шприц в образце. Протяните образец за пределы количества, которое вы хотите определить. Затем сведите плунжер до нужного количества, чтобы не было пузырьков воздуха.

Используйте кнопку, чтобы дозировать 0,5 микролитра и прикоснуться каплей к стержню. Дайте высохнуть, прежде чем положить следующую каплю на то же место. Наймите все образцы в линию на стержнях, удерживаемых над концом теплой конфорки.

Фокусировка в ацетоне. Фокусировка образца производится в 100% ацетоне. Добавьте примерно 70 мл ацетона на дно резервуара для разработки.

Возьмите две стойки и осторожно опуская их в танк разработки. Наблюдайте за тем, как растворитель поднимается по стержню, пока нижняя часть пятна не сольется с верхней частью пятна. Снимите стержни.

Высушите их в течение примерно пяти секунд, затем повторите процедуру. Если образцы очень концентрированы, эту фокусировку можно сделать в третий раз. Первая система разработки.

Первая система разработки состоит из гексана, этилового эфира и муравьиной кислоты от 98,5 до одного до 0,5. Начните с промывки градуированного цилиндра три раза гексаном и выброса. Заполните градуированный цилиндр чуть более 85 мл гексаном.

Затем используйте пипетку и флакон с гексаном, чтобы заполнить градуированный цилиндр до 90 мл. Затем доведите дно мениска до 91-мл линии с помощью этилового эфира, который даст один мл этилового эфира. Добавьте 0,5 мл муравьиной кислоты с помощью шприца Гамильтона.

Но сначала промыть шприц Гамильтона три раза муравьиной кислотой, чтобы убедиться, что не осталось хлороформа, который использовался для промывки образца из шприца. Добавьте два полных шприца или 25 микролитров за раз, в общей сложности 50 микролитров. Важно, чтобы муравьиная кислота немедленно промывалась из шприца хлороформом, чтобы избежать коррозии металла в шприце.

Как только шприц Гамильтона очистится, сделайте раствор ровно до 100 мл, используя гексан и пипетку. Затем колпачок и инвертировать три или четыре раза. Влейте примерно 30 мл в бак для разработки.

Используйте эти 30 мл, чтобы намочить бумагу и промыть резервуар. Откажитесь от раствора для полоскания. Добавьте оставшиеся 70 мл в танк разработки.

Добавление стоек в систему разработки. Добавление стержней в систему разработки одинаково для каждой разработки. Убедитесь, что таймер установлен на время разработки стержней.

А затем возьмите стойки и осторожно опуская их в бак. Следите за тем, пока передняя часть растворителя не достигнет мест образца, затем запустите таймер. Вторая система развития.

Вторая система разработки - гексан, этилен и муравьиная кислота, от 79 до 20 к одному. Так что, как и прежде, промыть градуированный цилиндр три раза гексаном. Добавьте ровно 20 мл эфира и затем один мл муравьиной кислоты, что доводит объем до 21 мл.

Затем доведите объем до 100 мл с гексаном. Добавьте около 75 мл гексана с помощью бутылочных насосов. А для порции используйте пипетку.

Колпачок и инвертировать несколько раз. Добавьте примерно 30 мл в резервуар для разработки, чтобы намочить бумагу и промыть резервуар. Выбросить 30 мл.

Добавьте оставшиеся 70, и он будет готов для набора стержней. Третья система развития. Третья система разработки представляет собой смесь хлороформа, метанола и хлороформ-экстрагированной воды, 50, 40 на 10.

Промыть градуированный цилиндр хлороформом три раза. Добавьте около 45 мл хлороформа. Используя пипетку, доведите дно мениска до отметки 50 мл.

Добавьте около 38 мл метанола. Доведите дно мениска до линии 90 мл. Затем заполните последние 10 мл водой, экстрагированной хлороформом.

Как и в случае с другими системами разработки, переверьте это три или четыре раза, а затем налейте 30 мл в резервуар, чтобы смочить бумагу. Отбросьте эти 30 мл и добавьте последние 70 мл в емкость. Приготовление метанола.

Чтобы составить раствор Hilditch, используемый для дериватизации, заполните чистую от липидов объемную колбу, которая также была либо высушена, либо промыта дополнительно три раза метанолом для удаления любого хлороформа. Добавляйте метанол до тех пор, пока дно мениска не будет на линии, содержащей ее. После измерения метанола добавьте сульфат натрия, который был высушен в течение не менее 24 часов при температуре 60 градусов Цельсия.

Добавьте достаточное количество сульфата натрия, чтобы он покрывала дно объемной метрической колбы. После покрытия перевернйте дважды, чтобы любая вода, которая находится в метаноле, поглощалась сульфатом натрия. После инвертирования и встряхивания дайте ему постоять не менее пяти минут.

Добавление кислоты. После того, как метанол осядевет через пять минут, медленно декантировать его в конечную стеклянную бутылку, гарантируя, что весь сульфат натрия останется на дне объемной колбы. Сульфат натрия обычно остается на дне, поэтому весь метанол должен слиться.

Оставьте объемный сульфатом натрия в задней части вытяжки для высыхания. Медленно добавляйте серную кислоту в метанол с помощью PIPETMAN. Добавляйте по несколько капель за раз, чтобы метанол не плевался.

После того, как вся кислота будет добавлена, крышкой и аккуратно перемешайте, чтобы перемешать. Решение теперь готово к использованию для деривативов, но оно должно составляться еженедельно. Изготовление деривативов.

Из флакона с экстрактом, объем которого доведен до известного количества, закрутите, затем удалите часть экстракта в липидно-чистый, помеченный флакон объемом 15 мл. Количество, которое вы удаляете, будет определяться концентрацией образца из Ятроскана. Используйте липидо-чистый пипет Драммонда для удаления образца.

После того, как образец был удален, поместите флакон 15 мл под азот, чтобы полностью испарить хлороформ. Исходный образец может быть сохранен и возвращен в морозильную камеру. Когда образец высушит, добавьте 1,5 мл дихлорметана или один пипет и три мл раствора Хилдитча, который был составлен ранее в тот же день, или два пипеталя.

Затем этот раствор выдерживают под азотом, вихрь и помещают в ультразвуковой аппарат в течение четырех минут, прежде чем поместить в духовку при 100 градусах Цельсия в течение одного часа. Остановка реакции. После нагревания при 100 цельсиях в течение часа и охлаждения медленно добавляют 0,5 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия.

Пузырьки будут производиться по мере нейтрализации кислоты. Затем добавить 1,5 мл гексана. Подведем итоги и энергично встряхните.

Дайте ему постоять так, чтобы он разделился на два слоя. Обработайте все образцы. К тому времени, когда все они будут закончены, первый будет готов к следующему шагу.

Удаление верхнего слоя. После того, как дериватизация была остановлена и во флаконе 15 мл произошло четкое разделение, удалите верхний слой и поместите его в липидно-чистый флакон с двумя мл. Лучше оставить часть верхнего слоя, чем и получить любой нижний слой во флакон с двумя мл.

После того, как большая часть верхнего слоя была удалена, остальная часть раствора может быть выброшена. Экстракт, который находится в двух мл, должен быть полностью выпарен под мягкой струей азота. Как только флакон полностью высохнет, гексан можно только только добавить, а затем образец следует обработать ультразвуком, выдержить под азотом, а затем он готов к отправке в ГК. Репрезентативные результаты.

На этом рисунке показаны сырые хроматограммы TLC-FIC нашего стандарта, диета, сделанная из рапсового масла и ткани печени лосося, получаемого этой диетой. Аквакультура, самый быстрорастущий сектор производства продуктов питания, должна уменьшить свою зависимость от рыбной млады и рыбьего жира из дикой природы. Растительные масла исследуются в качестве замены рыбьего жира в аквакормах.

А печень, первичный сайт для липидного обмена, нацелена на анализ. Мы можем видеть распространенность триацилглицеринов в рационе в печени, а также важность мембранных фосфолипидов в печени. На этом рисунке показаны хроматограммы стандарта.

Липиды и оседающие частицы собрались у побережья здесь, а липиды в мизиде собрались почти на той же глубине. Здесь хроматограммы были обработаны с помощью программного обеспечения для построения графиков. Будучи богатыми углеродом с очень высокой энергетической ценностью, липиды являются важным компонентом продуктивности шельфовых участков, которые особенно важны для круговорота углерода.

Больше поверхностной первичной продукции достигает морского дна в более мелкой воде. Мы обнаружили, что маленький мизид имеет самую высокую концентрацию липидов в наших образцах. Здесь сочетаются воск и стерильные эфиры.

И происходит пик расщепления из-за наличия высоких уровней полиненасыщенных жирных кислот. Скорость, с которой система Chromarod Iatroscan TLC-FID предоставляет синоптические данные о классе липидов из небольших образцов, делает ее мощным инструментом для скрининга морских образцов перед выполнением более подробных хроматографических анализов. Такие анализы обычно требуют высвобождения компонентных соединений из липидных экстрактов и дериватизации для повышения летучести.