В отличие от других метаболических путей, таких как утилизация глюкозы, синтез жирных кислот обычно не оценивается, что приводит к неполной интерпретации метаболического статуса. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он относительно неинвазивный и, вероятно, лучше отражает поток синтеза жирных кислот, чем использование меченной изотопами глюкозы, где изменения в предшествующей обработке глюкозы могут повлиять на результаты. Здесь мы сосредоточимся на бурой жировой ткани, но этот метод потенциально полезен для изучения любой ткани в любой мышиной модели.
Для начала поместите образцы на сухой лед. Возьмите предварительно маркированную пробирку для микроцентрифуги, поместите ее на аналитические весы и тарируйте весы. Затем поместите пинцет и скальпель или стальное лезвие бритвы на сухой лед на 10-20 секунд, чтобы он остыл.
С помощью пинцета выньте образец замороженной ткани из пробирки и поместите его на пластиковую грузовую лодочка, которую можно расположить на плоском блоке сухого льда или другой предварительно охлажденной поверхности. Используя скальпель или стальное бритвенное лезвие, рассеките небольшую часть ткани, эквивалентную весу от 5 до 15 миллиграммов, и поместите ее в пробирку микроцентрифуги. Запишите точный вес и повторите для каждого образца.
Добавьте один микролитр на миллиграмм 10 миллимолярной гексадекановой кислоты D31, а затем три пятимиллиметровых шарика из нержавеющей стали в каждый образец. Затем добавьте в каждый образец с шариками 250 микролитров метанола, 250 микролитров воды и 500 микролитров хлороформа. Поместите пробирки в предварительно охлажденный блок мельницы и перемешайте образцы с частотой колебаний 25 герц в течение пяти минут.
Извлеките шарики с помощью магнита и центрифугируйте образцы при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью микропипетки возьмите фиксированный объем нижней фазы каждого образца в пробирки для микроцентрифуг с соответствующей маркировкой. Добавьте 500 микролитров хлороформа к оставшемуся образцу и повторите эти действия.
Поместите пробирки с комбинированной нижней фазой под газообразный азот или в устойчивый к хлороформу охлаждаемый центробежный вакуум при температуре четыре градуса Цельсия до полного высыхания. Пипетка 98 миллилитров безводного метанола в стеклянный флакон с носителем. И медленно добавьте два миллилитра безводной серной кислоты в вытяжной шкаф, чтобы получить 2% серной кислоты в метаноле.
Перемешайте, взбалтывая закрытую бутылку. Добавьте 500 микролитров этой 2%-ной серной кислоты в растворе метанола к каждому образцу и кратковременно перемешайте. Инкубируют образцы на тепловом блоке при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов и добавляют в каждый образец 100 микролитров насыщенного раствора хлорида натрия и 500 микролитров гексана.
Энергично взбалтывайте образцы при комнатной температуре в течение одной минуты и оставьте образцы на одну минуту. После этого должны быть очевидны две фазы. Соберите верхнюю фазу в свежую пробирку для микроцентрифуги.
Затем повторите добавление гексана. А после разделения фаз соберите пробы второй верхней фазы в те же маркированные пробирки. Высушите образцы при комнатной температуре под газообразным азотом и повторно суспендируйте образцы в 20 микролитрах гексана на миллиграмм исходного веса ткани.
Немедленно переложите образцы в стеклянный флакон для газовой хроматографии со стеклянной вставкой. Введите образцы в один масс-спектрометр четырехкратной газовой хроматографии для определения содержания метиловых эфиров жирных кислот или изотопологов FAME. Введите один микролитр образца в разъемное или неразъемное входное отверстие при температуре на входе 270 градусов Цельсия, используя гелий в качестве газа-носителя.
В пробирках для микроцентрифуг с маркировкой с безопасным замком смешайте 10 микролитров каждого образца плазмы или стандартные четыре микролитра 10-молярного гидроксида натрия и четыре микролитра 5%-ного ацетона в ацетонитриле. Выполните это в трех экземплярах для каждого образца. После инкубации образцов в течение ночи при комнатной температуре добавьте от 450 до 550 миллиграммов сульфата натрия в каждый образец, добавьте 600 микролитров хлороформа в каждую пробирку в вытяжном шкафу и энергично встряхивайте в течение 15 секунд.
Центрифугируют образцы при 300 G в течение двух минут. Берут маркированные стеклянные флаконы GCMS со стеклянными вставками и переносят трипликат, а затем 80 микролитров аликвот надосадочной жидкости из каждого образца во флаконы. Плотно укупорьте флаконы для анализа GCMS.
Процент обогащения D2O в плазме мышей за несколько временных точек показан здесь. Было обнаружено, что вода в организме обогащается в диапазоне от 2,5 до 6%, что исходный уровень обогащения дейтерием в воде организма быстро достигается в течение одного часа и поддерживается в течение всего исследования. Показано массовое изотопологическое распределение пальмитата в бурой жировой ткани после трех дней введения D2O при комнатной температуре и термонейтральности.
Этот результат показывает более высокое обогащение дейтерием М1 и М2 при комнатной температуре. Обогащение моляров бурой жировой ткани и обогащение моляров плазмы ряда жирных кислот после трех дней введения D2O при комнатной температуре и термонейтральности представлены на этом рисунке. Более низкое температурное обогащение было обнаружено в широком спектре жирных кислот в бурой жировой ткани.
Примечательно, что общее обогащение жирными кислотами в плазме не следует той же тенденции, что и бурая жировая ткань, а вместо этого обогащение жирных кислот увеличивается с помощью термонейтральности. Эти изображения представляют общее количество и de novo синтезированный пальмитат в бурой жировой ткани после трех дней введения D2O. Результат показывает увеличение общего синтеза пальмитата при комнатной температуре.
Будьте осторожны при запуске жирных кислот на GCMS. Убедитесь, что пальмитат не перегружен, так как это может дать искусственно завышенные значения обогащения изотопов. Кроме того, при анализе ацетона на GCMS перед запуском образцов убедитесь, что нет фонового пика ацетона, поэтому запускайте пустые места, чтобы удалить ацетон из системы.
Этот метод рассматривает общее количество жирных кислот в нескольких классах липидов, но если вы хотите понять, как синтез жирных кислот влияет на определенные классы липидов, вы можете сначала разделить эти классы липидов с помощью хроматографии, а затем извлечь жирные кислоты из этих фракций. Поскольку липогенез является ключевым фактором нормального развития, а также многих заболеваний, этот протокол может быть полезен во многих областях.
