Этот протокол может быть использован для инактивации хромосомных генов для выделения мутантов для изучения функции генов и бактерий. Это делает процесс гомологичной рекомбинации простым, быстрым и высокоэффективным. Используя этот метод, гены, связанные с вирулентностью патогена, могут быть удалены для получения аттенуированного мутанта, который может быть использован в качестве кандидата для аттенуированной вакцины.
Начните с амплификации кассеты с хлорамфениколом, содержащей гемологические фрагменты гена micC. Разработка прямых и обратных праймеров для амплификации кассеты хлорамфеникола из плазмиды PKD3, включая 50 расширений гомологии пар оснований из пяти простых и трех простых концов гена micC. Проведите ПЦР, как описано в текстовой рукописи, используя плазмиду PKD3 в качестве шаблона для амплификации кассеты с хлорамфениколом.
Определяют размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем очистите продукт с помощью набора для восстановления геля ДНК и определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометрии. Проводят повторную ПЦР-реакцию для устранения помех дальнейшей рекомбинации плазмидой PKD3.
Разбавьте первый продукт ПЦР в соотношении 1 к 200 и используйте его в качестве шаблона для вторичной ПЦР. Чтобы сконструировать первый рекомбинантный штамм 50336 delta micC dot cat, смешайте 100 микролитров компетентных клеток SE 50336 с пятью микролитрами плазмиды PKD 46 и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Тепловой шок смеси при температуре 42 градуса Цельсия в течение 90 секунд и быстрый перенос ее обратно на лед в течение двух минут, чтобы превратить плазмиду в клетки.
Скрининг положительных колоний путем культивирования клеток в течение ночи при 30 градусах Цельсия на пластине, устойчивой к ампициллину. На следующий день добавьте еще 30 миллилитров арабинозы в жидкую культуру SE 50336 PKD 46 и индуцируйте экспрессию рекомбиназы с помощью часовой инкубации при 30 градусах Цельсия при встряхивании. Смешайте 100 нанограммов очищенного продукта ПЦР и 40 микролитров компетентных клеток SE 50336 PKD 46 в чашке для электрошока.
Затем проведите электрошоковую трансформацию. После электротрансформации перенесите смесь в один миллилитр среды SOC и встряхните культуральный инкубатор при 150 об/мин и 30 градусах Цельсия в течение одного часа. Распределите смесь на устойчивой к хлорамфениколу пластине LB и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия на ночь, чтобы выявить положительные колонии.
Культивируйте положительные колонии при температуре 42 градуса Цельсия в течение двух часов. Затем проверьте колонию на чувствительность к ампициллину и устойчивость к хлорамфениколу при 37 градусах Цельсия в течение ночи, чтобы получить первый рекомбинантный штамм без PKD 46. После экстракции геномной ДНК кошки 50336 Delta micC dot с помощью ПЦР и гель-электрофореза гальванизировать 100 нанограммов плазмиды PCP 20 в 40 микролитров 50336 точечных клеток кошек Delta micC.
Экранируйте положительные трансформаторы на пластинах, устойчивых к ампициллину и хлорамфениколу, при 30 градусах Цельсия. Перенесите положительные трансформаторы в нерезистентную жидкую среду LB и культивируйте их в течение ночи при температуре 42 градуса Цельсия. Затем изолируйте отдельные колонии на пластине LB при температуре 37 градусов по Цельсию.
Выберите колонию, которая чувствительна как к ампициллину, так и к хлорамфениколу. Этот мутант является делеционным мутантом micC SE 50336 Delta micC. Проверьте 50336 Delta micC, выполнив ПЦР, как описано в текстовой рукописи.
Этот протокол был использован для построения делеционного мутанта 50336 Delta micC в комплиментированном мутанте 50336 Delta micC, pmicC. Первая рекомбинантная кошка 50336 Delta micC dot была проверена методом ПЦР с ожидаемым размером полосы около 1200 пар оснований продуктов ПЦР с введением хлорамфеникола по сравнению с 279 парами оснований в штамме дикого типа. Во второй рекомбинации кассета с хлорамфениколом была устранена PCP 20.
Результаты ПЦР в сочетании с секвенированием подтвердили, что изогенный мутант micC был успешно построен. Экспрессию генов ompA, ompC и ompD в штаммах 50336, 50336 Delta micC и 50336 delta micC pmicC анализировали методом количественной ПЦР в реальном времени. Транскрипция ompA и ompC и 50336 delta micC увеличилась примерно в 2,2 раза и в три раза по сравнению со штаммом дикого типа.
В то время как транскрипция ompD увеличилась лишь незначительно. Анализы LD 50 показали, что после заражения мышей BALB/c в возрасте от шести до восьми недель каждым из трех штаммов большинство мышей, инфицированных 50336 Delta micC, проявляли усталость, отсутствие аппетита или диарею через 48 часов после заражения и умирали через 96 часов. Мыши, инфицированные штаммом дикого типа и 50336 delta micC pmicC, проявили те же симптомы через 72 часа после заражения и умерли через 120 часов.
LD 50 трех штаммов показали, что вирулентность мутанта 50336 Delta micC увеличилась в 2,5 раза по сравнению с диким типом. Этот метод помогает исследователям изучить функцию бактериальных генов и получить желаемый инженерный штамм путем удаления генов-мишеней.
