يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعطيل جينات الكروموسومات لعزل الطفرات لدراسة وظائف الجينات والبكتيريا. يجعل عملية إعادة التركيب المتماثل بسيطة وسريعة وعالية الكفاءة. باستخدام هذه التقنية ، يمكن حذف الجينات المرتبطة بالفوعة للممرض للحصول على الطافر الموهن الذي يمكن استخدامه كمرشح للقاح الموهن.
ابدأ بتضخيم شريط الكلورامفينيكول الذي يحتوي على شظايا دموية من جين micC. صمم بادئات أمامية وخلفية لتضخيم كاسيت الكلورامفينيكول من البلازميد PKD3 ، بما في ذلك 50 امتدادا لزوج التماثل الأساسي من الأطراف الأولية الخمسة والثلاثة الأولية لجين micC. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في المخطوطة النصية باستخدام بلازميد PKD3 كقالب لتضخيم كاسيت الكلورامفينيكول.
تحديد حجم المنتج PCR مع هلام الاغاروز الكهربائي. ثم قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة أدوات استعادة هلام الحمض النووي وتحديد تركيز الحمض النووي عن طريق القياس الطيفي. قم بإجراء تفاعل PCR ثان للقضاء على تداخل إعادة التركيب الإضافي بواسطة بلازميد PKD3.
قم بتخفيف أول منتج PCR بنسبة 1 إلى 200 واستخدمه كقالب ل PCR الثانوي. لبناء أول سلالة مؤتلفة 50336 دلتا ميك دوت كات ، امزج 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE 50336 مع خمسة ميكرولترات من بلازميد PKD 46 واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدم الخليط حراريا عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، وانقله بسرعة مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين لتحويل البلازميد إلى خلايا.
فحص المستعمرات الإيجابية عن طريق زراعة الخلايا طوال الليل عند 30 درجة مئوية على لوحة مقاومة للأمبيسيلين. في اليوم التالي ، أضف 30 مللي من L arabinose إلى الثقافة السائلة SE 50336 PKD 46 وحث على التعبير المؤتلف مع حضانة لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية أثناء الهز. امزج 100 نانوجرام من منتج PCR المنقى و 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE 50336 PKD 46 في كوب صدمة كهربائية.
ثم نفذ تحويل الصدمة الكهربائية. بعد التحول الكهربائي ، انقل الخليط إلى ملليلتر واحد من وسط SOC وحاضنة ثقافة الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. انشر الخليط على طبق LB مقاوم للكلورامفينيكول واستزرعه عند 37 درجة مئوية طوال الليل لفحص المستعمرات الإيجابية.
استزرع المستعمرات الموجبة عند 42 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم قم بفحص المستعمرة بحثا عن حساسية للأمبيسيلين ومقاومة الكلورامفينيكول عند 37 درجة مئوية طوال الليل للحصول على أول سلالة مؤتلفة بدون PKD 46. بعد استخراج الحمض النووي الجينومي للقطط 50336 Delta micC dot باستخدام PCR والرحلان الكهربائي الهلامي ، قم بتزويد 100 نانوجرام من البلازميد PCP 20 بالكهرباء إلى 40 ميكرولتر من 50336 Delta micC dot cat.
فحص المحولات الموجبة على كل من الألواح المقاومة للأمبيسيلين والكلورامفينيكول عند 30 درجة مئوية. انقل المحولات الموجبة إلى وسط سائل LB غير مقاوم واستزرعها طوال الليل عند 42 درجة مئوية. ثم اعزل المستعمرات المفردة على صفيحة LB عند 37 درجة مئوية.
حدد المستعمرة الحساسة لكل من الأمبيسلين والكلورامفينيكول. هذا المسخ هو متحولة حذف micC SE 50336 Delta micC. تحقق من 50336 Delta micC عن طريق إجراء PCR كما هو موضح في المخطوطة النصية.
تم استخدام هذا البروتوكول لإنشاء متحولة الحذف 50336 Delta micC في متحولة 50336 Delta micC ، pmicC. تم التحقق من صحة أول قطة منقوصة 50336 Delta micC dot المؤتلفة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم نطاق متوقع يبلغ حوالي 1200 زوج أساسي من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع إدخال الكلورامفينيكول مقارنة ب 279 زوجا أساسيا في سلالة النوع البري. في إعادة التركيب الثانية ، تم التخلص من كاسيت الكلورامفينيكول بواسطة PCP 20.
أكدت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل جنبا إلى جنب مع التسلسل أن طفرة الميكروفون إيزوجينيك قد تم بناؤها بنجاح. تم تحليل التعبير عن جينات ompA و ompC و ompD في السلالات 50336 و 50336 Delta micC و 50336 delta micC pmicC بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. زاد نسخ ompA و ompC و 50336 delta micC بحوالي 2.2 ضعف وثلاثة أضعاف مقارنة بسلالة النوع البري.
في حين أن نسخ ompD زاد قليلا فقط. أظهرت فحوصات LD 50 أنه بعد إصابة الفئران BALB / c البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع بكل من السلالات الثلاث ، أظهرت معظم الفئران المصابة ب 50336 Delta micC التراخي أو عدم الشهية أو الإسهال بعد 48 ساعة من الإصابة وتوفيت بعد 96 ساعة. أظهرت الفئران المصابة بسلالة من النوع البري و 50336 delta micC pmicC نفس الأعراض بعد 72 ساعة من الإصابة وماتت بعد 120 ساعة.
أشارت LD 50s من السلالات الثلاث إلى أن ضراوة 50336 Delta micC المتحولة عززت 2.5 ضعف مقارنة بالنوع البري. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة وظيفة الجينات البكتيرية والحصول على السلالة المهندسة المطلوبة عن طريق حذف الجينات المستهدفة.
