Ce protocole peut être utilisé pour inactiver les gènes chromosomiques afin d’isoler les mutants pour l’étude de la fonction des gènes et des bactéries. Il rend le processus de recombinaison homologue simple, rapide et très efficace. En utilisant cette technique, les gènes liés à la virulence de l’agent pathogène peuvent être supprimés pour obtenir le mutant atténué qui peut être utilisé comme candidat pour le vaccin atténué.
Commencez par amplifier la cassette de chloramphénicol contenant des fragments hémologiques du gène micC. Concevoir des amorces avant et arrière pour amplifier la cassette de chloramphénicol à partir du plasmide PKD3, y compris 50 extensions d’homologie de paires de bases des cinq extrémités premières et des trois extrémités premières du gène micC. Effectuer la PCR comme décrit dans le manuscrit en utilisant le plasmide PKD3 comme modèle pour amplifier la cassette de chloramphénicol.
Déterminer la taille du produit PCR avec électrophorèse sur gel d’agarose. Purifiez ensuite le produit avec un kit de récupération de gel d’ADN et déterminez la concentration d’ADN par spectrophotométrie. Effectuer une deuxième réaction PCR pour éliminer l’interférence d’une recombinaison ultérieure par le plasmide PKD3.
Diluez le premier produit de PCR dans un rapport de 1 à 200 et utilisez-le comme modèle pour la PCR secondaire. Pour construire la première souche recombinante 50336 delta micC dot cat, mélanger 100 microlitres de cellules compétentes SE 50336 avec cinq microlitres de plasmide PKD 46 et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Choquer le mélange à 42 degrés Celsius pendant 90 secondes et le transférer rapidement sur la glace pendant deux minutes pour transformer le plasmide en cellules.
Dépistage des colonies positives en cultivant les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius sur une plaque résistante à l’ampicilline. Le lendemain, ajoutez 30 milli de L arabinose supplémentaire à la culture liquide SE 50336 PKD 46 et induisez l’expression de la recombinase avec une incubation d’une heure à 30 degrés Celsius tout en agitant. Mélanger 100 nanogrammes du produit PCR purifié et 40 microlitres de cellules compétentes SE 50336 PKD 46 dans une coupelle à choc électrique.
Ensuite, effectuez la transformation par choc électrique. Après électrotransformation, transférer le mélange dans un millilitre de milieu SOC et un incubateur de culture à agitation à 150 tr / min et 30 degrés Celsius pendant une heure. Étaler le mélange sur une plaque LB résistante au chloramphénicol et la cultiver à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour dépister les colonies positives.
Culture des colonies positives à 42 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, la colonie a examiné la sensibilité à l’ampicilline et la résistance au chloramphénicol à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour obtenir la première souche recombinante sans PKD 46. Après avoir extrait l’ADN génomique du chat point 50336 Delta micC par PCR et électrophorèse sur gel, électroplaque 100 nanogrammes de plasmide PCP 20 dans 40 microlitres de cellules compétentes 50336 Delta micC point cat.
Criblez les transformants positifs sur des plaques résistantes à l’ampicilline et au chloramphénicol à 30 degrés Celsius. Transférer les transformants positifs dans un milieu liquide LB non résistant et les cultiver pendant la nuit à 42 degrés Celsius. Ensuite, isolez les colonies individuelles sur une plaque LB à 37 degrés Celsius.
Sélectionnez la colonie sensible à l’ampicilline et au chloramphénicol. Ce mutant est le mutant de délétion micC SE 50336 Delta micC. Vérifiez 50336 Delta micC en effectuant une PCR comme décrit dans le manuscrit texte.
Ce protocole a été utilisé pour construire le mutant de délétion 50336 Delta micC dans le mutant 50336 Delta micC complimenté, pmicC. Le premier chat recombinant 50336 Delta micC point cat a été validé par PCR avec une taille de bande attendue d’environ 1200 paires de bases de produits PCR avec l’insertion de chloramphénicol contre 279 paires de bases dans la souche de type sauvage. Dans la deuxième recombinaison, la cassette de chloramphénicol a été éliminée par PCP 20.
Les résultats de la PCR combinés au séquençage ont confirmé que le mutant micC isogénique a été construit avec succès. L’expression des gènes ompA, ompC et ompD dans les souches 50336, 50336 Delta micC et 50336 delta micC pmicC a été analysée par PCR quantitative en temps réel. La transcription de ompA et ompC et 50336 delta micC a augmenté d’environ 2,2 fois et triplé par rapport à la souche de type sauvage.
Alors que la transcription de ompD n’a augmenté que légèrement. Les tests DL 50 ont montré qu’après avoir infecté des souris BALB / c âgées de six à huit semaines avec chacune des trois souches, la plupart des souris infectées par 50336 Delta micC présentaient une lassitude, une inappétence ou une diarrhée 48 heures après l’infection et mouraient après 96 heures. Les souris infectées par la souche de type sauvage et 50336 delta micC pmicC ont présenté les mêmes symptômes 72 heures après l’infection et sont mortes après 120 heures.
Les DL 50 des trois souches ont indiqué que la virulence du mutant 50336 Delta micC était multipliée par 2,5 par rapport au type sauvage. Cette technique aide les chercheurs à étudier la fonction des gènes bactériens et à obtenir la souche modifiée souhaitée en supprimant les gènes cibles.
