Антитела регулярно используются в лабораторных методах, и их терапевтическое и диагностическое применение быстро расширяется. Быстрая и точная характеристика связывания антиген-антител критически важна для этих применений. Массовая фотометрия быстро измеряет связывающие сходства, используя крайне небольшое количество материала.
Маркировка или иммобилизация не требуются, и информация о олигомеризации и чистоте белка может быть получена из того же эксперимента. Этот протокол может быть использован не только для изучения антител, но и для измерения сильных белково-белковых связей для белков с молекулярной массой более 50 килодальтонов. Начните с использования мягкого наконечника типсов и мыть бутылки последовательно промыть 24 на 50 миллиметров coverslips сверху вниз с дистиллированной водой, этанолом, дистиллированной водой, изопропанол, и дистиллированной воды.
После последней стирки высушите крышки потоком чистого азота в том же направлении, чтобы избежать переноса загрязнения из типсов. Промыть 24 на 24 миллиметра крышки с дистиллированной водой и этанолом, как попродемонстрировано, а затем сушки с потоком чистого азота. После высыхания поместите 24 на 24 миллиметра крышку на кусок алюминиевой фольги и поместите полоски односторонней ленты на крышку.
Затем вырежьте 24 на 24 миллиметра крышки из фольги и осторожно нажмите фольгу на рабочую сторону 24 на 50 миллиметров крышки. Чтобы подготовить образцы антител-антигенов для измерений сродства, фильтруем по крайней мере два миллилитров PBS через фильтр шприца 0,22 микрона для удаления частиц и агрегатов пыли, а также центрифугируют запасы антител и антигенов, представляющие интерес. Измерьте 280 нанометровую уф-абсорбцию запасов антител и антигенов, чтобы определить их фактическую концентрацию, и подготовьте серию антител-антигенных смесей в соответствующем диапазоне концентраций антигена в окончательном объеме 50 микролитров на образец.
Затем инкубировать антиген-антитела смеси в течение примерно 10 минут при комнатной температуре, чтобы обязательная реакция достичь химического равновесия. Для оценки сродства антител-антигенов по массовой фотометрии нанесите каплю масла погружения микроскопа на цель прибора и поместите камеру потока на стадию микроскопа. Добавьте 10 микролитров фильтрованного PBS к одному концу канала камеры потока.
Буфер войдет в канал с помощью капиллярного действия. Во вкладке управления фокусом программного обеспечения для сбора данных используйте грубые кнопки вверх и вниз, чтобы внести первоначальные коррективы и щелкнуть резкостью, чтобы просмотреть считывание сигнала резкости. Используйте штраф вверх и вниз кнопки регулировки, чтобы максимизировать значение резкости и нажмите кнопку фокусировки и блокировки фокус, чтобы активировать функцию отслеживания фокусировки.
Изображение чистого слайда должно иметь сигнальное значение, равное или ниже 0,05%Load 20 микролитров первого образца антитела-антигена, как попродемонстрировано, смая жидкость с другого конца небольшим куском бумаги. Сразу после загрузки нажмите запись, чтобы получить соответствующее количество кадров, эквивалентное 100 секунд данных. В конце периода сбора данных введите имя файла для данных и нажмите OK, а затем образец, чтобы сохранить файл.
Чтобы проанализировать данные массовой фотометрии, откройте файл, представляющий интерес, и нажмите анализ. Нажмите нагрузку, чтобы загрузить функцию калибровки и нажмите файл и сохранить результаты, чтобы сохранить проанализированные данные. Чтобы получить относительную концентрацию каждого вида в образце, откройте событияfitted.
csv файл, скопировать данные в колонке M в соответствующее программное обеспечение построения и анализа, и использовать функцию гистограммы статистики сюжета для построения молекулярной массы распределения. Дважды нажмите на гистограмму, чтобы открыть окно свойств участка, отключить автоматическое биннинг и выбрать размер ячеек 2,5 килодалтонов. Чтобы создать бен-центры и рассчитывает данные, нажмите применить и идти.
Чтобы соответствовать гистограмме с функциями Gaussian, выберите бен-центры и считает столбцы и нажмите на пики анализа и базовые несколько пиковых функций меню. Дважды щелкните, чтобы указать приблизительные пиковые позиции на участке распределения и нажмите кнопку открытой NL fit. Проверьте фиксированные флажки для пиковых центров XC и установите их значения на ожидаемые молекулярные массы свободных антител и одиночные и двойные антиген-антитела комплексов.
Проверьте опцию share для параметров ширины и нажмите fit. Установленные пиковые значения высоты гауссийских компонентов отражают относительную концентрацию каждого вида в образце. Затем используйте уравнение для расчета доли концентрации каждого вида из пиковых значений высоты.
Чтобы вычислить равновесные константы с помощью программы электронной таблицы, откройте диссоциациюконстанткаляцию. xlsx лист. В этом листе желтые выделенные значения ячеев в строках от 1 до 10 могут быть изменены для выполнения равновесных постоянных вычислений.
Введите предполагаемые диссоциации постоянных значений в наномолярных единиц в клетки B1 и B2. Если предполагаемые константы диссоциации неизвестны, оставьте значения по умолчанию в ячейках B1 и B2 без изменений. Введите общие антитела и общие концентрации антигена в наномолярных единицах в клетки D2 и E2 и введите рассчитанные значения фракций для каждого вида в клетки F2, G2 и H2. При проведении глобального анализа титровали добавьте соответствующие значения фракций данных в строки от 2 до 10. В окне параметров решатера выберите ячейку B15 для установленного объективного ящика и ячейки B1 к B2 для изменя переменную ячейку коробки.
Выберите кнопку мин для опции и проверить сделать неограниченные переменные не-отрицательный флажок, а затем выбрать GRG нелинейный в качестве метода решения и нажмите решить. Наилучшие значения диссоциации будут показаны в клетках B1 и B2. А окончательная сумма ошибок в квадрате будет показана в ячейке B15. В этом репрезентативном эксперименте, серия титрование с антителами анти-человеческого тромбина при фиксированной концентрации 25 наномолярных и 0, 7.5, 15, 30, 60 и 120 наномолярных человеческих концентраций альфа-тромбина человека были выполнены для получения молекулярной массы распределения антиген-антитела смесей и антител только образец.
Наилучшие пиковые параметры высоты гауссийских компонентов были нормализованы для получения фракций концентрации видов. Значения фракции концентрации после этого были приспособлены глобально для того чтобы получить антиген-антитела связывая сходства. Экспериментальные фракции концентрации и глобальные результаты подходят для свободного антитела, одного антиген-антитела комплекса, и двойной антигенный комплекс может быть построен.
Чтобы получить точные значения KD, концентрации белка должны быть тщательно отобраны, чтобы заполнить все виды реакции. Мы рекомендуем подготовить серию титрова с использованием ряда концентраций антигенов. После установки данных метод проекции ошибки может быть использован для получения подходящей ошибки, но лучше повторить эксперимент и вычислить стандартные отклонения средних связывающих значений сродства.
