FILM-FRET является мощным методом, который позволяет подтвердить предполагаемые или прогнозируемые взаимодействия белка-белка. В этом протоколе мы представляем способ анализа данных в конкретных случаях несбалансированного количества доноров и принимаетеля. FILM-FRET способен предоставлять информацию о белково-белковых взаимодействиях непосредственно в живых клетках.
Важно исследовать лично-белковые взаимодействия в родной клеточной среде, в частности, когда флуоресцентный белок выражается в эндогенном уровне. Начните с выращивания P.aeruginosa, E.coli TOP10, и E.coli помощник бактерий каждый из пяти миллилитров LB без антибиотиков при 30 градусов по Цельсию во время встряхивания в одночасье. На следующий день, измерить оптическую плотность культур и смешать равное количество P.aeruginosa, E.coli TOP10 и E.coli помощник в 1,5 миллилитров микротрубки.
Центрифуга трубки в течение пяти минут на 9, 300 раз G гранулы бактерий, а затем отказаться от супернатанта и повторно гранулы в 50 микролитров LB. Плита пятно смеси на разогретой LB агар и инкубировать его в течение пяти часов при 37 градусов по Цельсию. После инкубации, соскребать пятно с стерильной петли прививки и повторно его в один миллилитр LB. Плита 100 микролитров этой бактериальной суспензии на LB агар, содержащий 10 микрограммов на миллилитр хлорамфеникол и 30 микрограммов на миллилитр гентамицин и инкубировать два дня при 37 градусах по Цельсию для устранения E.coli TOP10 и E.coli помощник бактерий. Resuspend одной колонии в один миллилитр LB и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию с орбитальной тряски в течение четырех часов, а затем центрифугировать трубку в течение трех минут в 9, 300 раз G и отказаться от 950 микролитров супернатанта.
Resuspend гранулы в 50 микролитров LB и изолировать смесь на LB агар, содержащий сахарозу и не хлорид натрия. Инкубировать пластину на ночь при 30 градусах по Цельсию. Пятно изолированных колоний на LB агар и LB агар, содержащий 15 миллиграммов на миллилитр гентамицин для того, чтобы проверить на чувствительность гентамицина.
Поместите стеклянный слайд микроскопа на плоскую горизонтальную поверхность и расположить два стеклянных слайда, увенчанных двумя слоями клейкой ленты вокруг него. Pipette 70 микролитров капли 1%melted агарозы на стеклянную горку и место четвертой слайд на вершине, чтобы сгладить капли агарозы. Нажмите вниз осторожно в течение минуты.
Смей верхнюю горку и урони около трех микролитров бактерий в трех-четырех местах в разных местах на агарозной площадке. Обложка агарозы площадку с микроскопией стеклянной крышкой и исправить его с расплавленным парафином, чтобы запечатать его на стеклянную горку, начиная с четырех углов. Поместите слайд микроскопии на сцену с крышкой перед целью.
Поверните башню кубика фильтра, чтобы выбрать кубик eGFP и откройте затвор лампы флуоресценции, а затем отправьте свет флуоресценции к окуляру микроскопа. Сосредоточьте цель на бактериях с помощью ручки микроскопа. Выберите область интереса к образцу с помощью джойстика, который управляет моторизованной стадией.
Отправить флуоресценции выбросов путь обратно к детектору, а затем повернуть назад фильтр куб башни, чтобы выбрать дихроический куб для 930 нанометрового лазера и установить мощность лазера до 20 милливатт. Установите размер области интереса до 30 микрометров, которая регулирует напряжение, работающее на зеркалах galvo, и определяет диапазон их движений. Включите детектор и начните сканирование образца.
Выберите поле зрения для визуализации, тонко перемещая сцену из компьютерного интерфейса. Это может быть сделано на установку путем перемещения креста на изображение в микроскоп управления программным обеспечением, которое будет определять новый центр изображения и нажатия стадии перемещения. Хорошее поле зрения для приобретения должно содержать от 10 до 30 неподвижных бактерий все в фокусе.
Если вы заинтересованы в извлечении одной клетки FILM-FRET данных, убедитесь, что бактерии хорошо индивидуализированы. Откройте программное обеспечение для визуализации и убедитесь, что скорость подсчета фотона не слишком высока, чтобы избежать эффекта накопления, который может повлиять на измерения продолжительности жизни. При необходимости снизить интенсивность лазера, чтобы сохранить скорость подсчета фотона на низком уровне.
Отрегулируйте параметры приобретения, включая время сбора приобретения. Нажмите кнопку «Пуск» и дождись завершения приобретения. Для анализа данных откройте RStudio и создайте новый проект.
Создайте новую папку в основной папке проекта и назовите ее данными, а затем переместите все файлы анализа в эту папку. Откройте новый файл скрипта или дополнительный скрипт flim_analysis.r. Установите специальный пакет FlimDiagRam для анализа данных о фильмах и позвоните пакету в рабочее пространство.
Здесь показаны эмпирические кумулятивные распределительные функции жизней флуоресценции, измеряемые для различных бактериальных штаммов. Если ПРОИСХОДИТ ФРЕТ, функции смещаются в сторону более коротких сроков службы. Важно отметить, что FRET не может произойти, когда взаимодействие двух белков приводит к большому расстоянию между двумя флюрофорами, что нельзя отличить от отсутствия взаимодействия.
Таким образом, это может быть необходимо для обозначения белков в разных позициях, чтобы максимизировать шансы зондирования взаимодействия. Из-за большой разницы в выражениях белка между PvdA и PvdL, тот же комплекс не приводит к аналогичным FILM-FRET данных. Несбалансированные стоихиометрии приводят к различиям в вкладе свободных по сравнению с связанными донорами белками в зарегистрированном распределении сроков службы флуоресценции.
Сюжет диаграммы может быть использован для предоставления важной информации о стоитиометрии. В pvdA-eGFP mCherry-PvdL мутант, количество доноров помечены PvdA гораздо выше, чем количество mCherry-PvdL. Среди всех доноров, присутствующих в выборке, лишь немногие из них взаимодействуют с PvdL.
Одно тау-одно значение, сосредоточенное примерно на 2,3 наносекунды, позволяет предположить, что каждый донор PvdA-eGFP может передаваться только с помощью одного принимаетеля mCherry-PvdL. Когда маркировка обращена вспять, большинство белков eGFP-PvdL, как ожидается, будут взаимодействовать с PvdA-mCherry, что подтверждается более высокими значениями альфа-один. Значения tau одно стали более распределенными предлагая что множественные протеины PvdA могут связать к одному протеину PvdL.
Установка FLIM становится доступной во все большем числе объектов визуализации. Образцы изображений в FILM-FRET не сложнее, чем изображения в видео микроскопии.
