FILM-FRET ist eine leistungsstarke Technik, die es ermöglicht, vermutete oder vorhergesagte Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen. In diesem Protokoll stellen wir eine Möglichkeit zur Analyse von Daten in bestimmten Fällen unausgewogener Spender- und Akzeptanzmengen dar. FILM-FRET ist in der Lage, Informationen über die Protein-Protein-Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen zu liefern.
Es ist wichtig, persönliche Protein-Wechselwirkungen in der nativen zellulären Umgebung zu untersuchen, insbesondere wenn fluoreszierendes Protein im endogenen Niveau exprimiert wird. Beginnen Sie mit dem Anbau von P.aeruginosa, E.coli TOP10 und E.coli-Helferbakterien in fünf Millilitern LB ohne Antibiotikum bei 30 Grad Celsius, während sie über Nacht zittern. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Kulturen und mischen Sie eine gleiche Menge p.aeruginosa, E.coli TOP10 und E.coli-Helfer in einem 1,5 Milliliter Mikrotube.
Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 9, 300 mal G, um die Bakterien zu pellet, dann entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 50 Mikroliter LB. Einen Punkt der Mischung auf vorgeheizten LB-Agar aufteilen und fünf Stunden bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation den Spot mit einer sterilen Impfschleife kratzen und in einem Milliliter LB wieder aufhängen. Platte 100 Mikroliter dieser bakteriellen Suspension auf LB Agar enthält 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 30 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin und inkubieren zwei Tage bei 37 Grad Celsius E.coli TOP10 und E.coli Helfer Bakterien zu beseitigen. Eine Kolonie in einem Milliliter LB wieder aufhängen und bei 37 Grad Celsius mit Orbitalschütteln für vier Stunden bebrüten, dann das Rohr drei Minuten lang bei 9, 300 mal G zentrifugieren und 950 Mikroliter Überstand entsorgen.
Setzen Sie das Pellet in 50 Mikroliter LB aus und isolieren Sie das Gemisch auf LB-Agar, der Saccharose und kein Natriumchlorid enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Entdecken Sie isolierte Kolonien auf LB-Agar und LB-Agar mit 15 Milligramm pro Milliliter Gentamycin, um die Gentamycin-Empfindlichkeit zu überprüfen.
Legen Sie einen Mikroskopglasschlitten auf eine flache horizontale Oberfläche und ordnen Sie zwei Glasgrutschen mit zwei Schichten Klebeband um sie herum. Pipette ein 70 Mikroliter Tröpfchen von 1%geschmolzenem Agarose auf die Glasrutsche und legen Sie eine vierte Rutsche auf die Oberseite, um den Agarose-Tröpf abzuflachen. Drücken Sie vorsichtig für etwa eine Minute nach unten.
Nehmen Sie die obere Rutsche ab und lassen Sie etwa drei Mikroliter Bakterien an drei bis vier Stellen an verschiedenen Stellen auf dem Agarose-Pad fallen. Bedecken Sie das Agarose-Pad mit einem Mikroglas-Coverslip und fixieren Sie es mit geschmolzenem Paraffin, um es ab den vier Ecken auf dem Glasschlitten zu versiegeln. Platzieren Sie die Mikroskopiefolie auf der Bühne mit dem Deckelschlupf zum Objektiv.
Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den eGFP-Würfel auszuwählen, und öffnen Sie den Fluoreszenzlampenverschluss, und senden Sie dann das Fluoreszenzlicht in Richtung des Okulars des Mikroskops. Konzentrieren Sie das Ziel mit dem Mikroskopknopf auf die Bakterien. Wählen Sie einen Bereich aus, der für die Probe von Interesse ist, indem Sie den Joystick verwenden, der die motorisierte Phase steuert.
Senden Sie den Fluoreszenz-Emissionspfad zurück zum Detektor, drehen Sie dann den Filterwürfelturm zurück, um den dichroitischen Würfel für den 930-Nanometer-Laser auszuwählen, und stellen Sie die Laserleistung auf 20 Milliwatt ein. Stellen Sie die Größe des Interessenbereichs auf 30 Mikrometer ein, wodurch die Spannung, die die Galvospiegel bedient, eingestellt wird und der Bereich ihrer Bewegungen definiert wird. Schalten Sie den Detektor ein und starten Sie das Scannen der Probe.
Wählen Sie das Sichtfeld für die Bildgebung aus, indem Sie die Bühne fein von der Computeroberfläche aus verschieben. Dies kann auf dem Setup durch Verschieben des Kreuzes auf dem Bild in der Mikroskop-Steuerungssoftware, die die neue Mitte des Bildes und Drücken Bewegungsstufe definieren. Ein gutes Sichtfeld für den Erwerb sollte 10 bis 30 unbewegliche Bakterien enthalten.
Wenn Sie an der Extraktion von Einzelzellen FILM-FRET-Daten interessiert sind, stellen Sie sicher, dass die Bakterien gut individualisiert sind. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und überprüfen Sie, ob die Photonenanzahl nicht zu hoch ist, um einen Anhäufungseffekt zu vermeiden, der Die Lebensdauermessungen beeinflussen kann. Senken Sie bei Bedarf die Laserintensität, um die Photonenanzahl niedrig zu halten.
Passen Sie Erfassungsparameter einschließlich der Erfassungserfassungszeit an. Drücken Sie die Starttaste und warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie RStudio, und erstellen Sie ein neues Projekt.
Erstellen Sie einen neuen Ordner im Hauptprojektordner, und benennen Sie ihn als Daten, und verschieben Sie dann alle Analysefragendateien in diesen Ordner. Öffnen Sie eine neue Skriptdatei oder das zusätzliche Skript flim_analysis.r. Installieren Sie das spezielle FlimDiagRam-Paket für die Filmdatenanalyse und rufen Sie das Paket im Arbeitsbereich auf.
Empirische kumulative Verteilungsfunktionen der fluoreszenz-Lebensdauern, die für die verschiedenen Bakterienstämme gemessen werden, werden hier gezeigt. Wenn FRET auftritt, werden die Funktionen in die kürzere Lebensdauer verschoben. Es ist wichtig zu beachten, dass FRET nicht auftreten kann, wenn die Interaktion der beiden Proteine zu einem langen Abstand zwischen den beiden Flurophoren führt, der nicht von der Abwesenheit von Interaktion unterschieden werden kann.
Daher kann es notwendig sein, die Proteine an verschiedenen Positionen zu kennzeichnen, um die Chancen zu maximieren, die Wechselwirkung zu prüfen. Aufgrund des großen Unterschieds in den Proteinausdrücken zwischen PvdA und PvdL führt derselbe Komplex nicht zu ähnlichen FILM-FRET-Daten. Unausgewogene Stoichiometrien führen zu Unterschieden im Beitrag der freien im Vergleich zu den gebundenen spendermarkierten Proteinen in der aufgezeichneten Fluoreszenz-Lebensdauerverteilung.
Das Diagrammdiagramm kann verwendet werden, um wichtige Informationen über die Stoichiometrie bereitzustellen. In der PvdA-eGFP mCherry-PvdL-Mutation ist die Menge an PvdA mit Spenderkennzeichnung viel höher als die Menge an mCherry-PvdL. Von allen Spendern, die in der Stichprobe anwesend sind, interagieren nur wenige von ihnen mit PvdL.
Der einzelne Tau-Eins-Wert, der auf ca. 2,3 Nanosekunden zentriert ist, legt nahe, dass jeder PvdA-eGFP-Spender nur mit einem mCherry-PvdL-Akzeptor übertragen kann. Wenn die Kennzeichnung umgekehrt ist, wird erwartet, dass die meisten eGFP-PvdL-Proteine mit PvdA-mCherry interagieren, was durch die höheren Alpha-Ein-Werte bestätigt wird. Die Tau-Ein-Werte wurden stärker verteilt, was darauf hindeutet, dass mehrere PvdA-Proteine an ein einzelnes PvdL-Protein binden können.
Das FLIM-Setup wird in immer mehr Bildverarbeitungseinrichtungen verfügbar. Die Bildgebung von Proben in einem FILM-FRET ist nicht komplizierter als die Bildgebung in der Videomikroskopie.
