Edhazardia aedis является микроспоридским паразитом, который специально заражает комаров Aedes aegypti. Воспитание этого паразита может быть сложной задачей для новых исследователей из-за сложности жизненного цикла паразита. Этот протокол содержит пошаговую инструкцию по воспитанию E.aedis, в том числе, как правильно время шаги к процедуре, выявления инфекционных спор, и распространять следующее поколение паразитов.
Точное время этого протокола может быть сложным и может потребовать некоторых проб и ошибок. Выявление спор также может быть трудно. Визуальные пособия в этом протоколе должны оказывать помощь.
Для начала вылупляйте яйца A.Aegypti, зараженные E.aedis, помещая их в личиноносный поднос с одним литром деионизированной воды и добавляя 50 миллиграммов рыбной пищи. Дом комаров на 27 градусов по Цельсию и 80%относительной влажности с 14-часовой свет, 10-часовой темный цикл. После вылупления уменьшите плотность личинок примерно до 100 личинок на лоток, делая новые лотки по мере необходимости.
Добавьте кусок сухого кошачьего еды к каждому подносу. Пополнить пищу, когда истощены, но не обеспечивают каких-либо избыток пищи. Один 200 миллиграмм кусок кошачьего питания каждые три дня достаточно.
Когда инфицированные личинки являются третьими-четвертыми звездами, люк неинфицированных яиц A.aegypti в новый лоток. Задняя комаров при плотности такова, что здоровый A.aegypti достичь второй до третьей звезды в 48 до 72 часов. Hatching партии здоровых яиц в течение нескольких дней может гарантировать, что личинки находятся на правильной стадии, когда это необходимо.
Для сбора и количественной оценки однонуклеатных спор используйте трубу для переноса 10 инфицированных четвертых личинок instar в микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра. Удалите селекционную воду с помощью пересадочной пипетки и вымойте личинки один раз, добавив примерно один миллилитр чистой деионизированной воды. Удалите промывку воды и добавьте 500 микролитров чистой деионизированной воды в 10 личинок и гомогенизируйте их с помощью пестика и механического гомогенизатора.
Загрузите 10 микролитров гомогената на гемоцитометр и количественно оцените споры при увеличении 400X. Сделайте свежую личиночную пищевую суспензию, смешивая 1,2 грамма порошка печени, 0,8 грамма пивных дрожжей и 100 миллилитров воды. Передача 100 секунд до третьего instar здоровых личинок A.aegypti в 150 миллилитров стаканов или чашки образца и добавить пять раз от 10 до четвертого до одного раза от 10 до пятой споры в каждой чашке с пипеткой.
Добавьте два миллилитров лиственницы пищевой суспензии и деионизированной воды для конечного объема в 100 миллилитров. После 12 до 24 часов воздействия, передать личинки в выращивание лотки. Добавляйте пищу и подготовьте их во взрослую жизнь.
Мониторинг досированных личинок для окукливания и передачи куколок в чашку появления в клетке. Сахар кормить взрослых объявление libitum. Кровь кормит взрослых в соответствии со стандартными протоколами, доступными через BEI Resources.
Собирайте яйца у сытых кровью взрослых. Вертикальная передача E.aedis происходит на этом этапе. После завершения, очистить все материалы, которые в контакте с E.aedis с 10%bleach и автоклавирования для предотвращения загрязнения.
Этот протокол демонстрирует всю процедуру, необходимую для распространения E.aedis у комаров A.aegypti. Яйца A.aegypti, инфицированные Э.аедисом, вылупились, а личинки были вырасти до четвертой стадии instar. В четвертой стадии instar, визуальные признаки инфекции можно было наблюдать, такие как белые sporocysts по всему жировых тел инфицированных личинок.
Унинуклеатные споры были собраны из четвертых личинок instar путем гомогенизации 10 личинок в 500 микролитров деионизированной воды. Эти споры были пириформные и легко видны при увеличении 400X. Было подсчитано количество спор 4 050 спор на микролитер, и эти споры использовались для заражения здоровых личинок через горизонтальную передачу.
Инфекционный статус и E.aedis нагрузок 25 личинок семейного поколения были оценены в семь дней после вылупления. Вертикальный уровень инфекции E.aedis в поколении фили было установлено, что 96%и средняя нагрузка спор инфицированных людей в семь дней после вылупления было 3,31 раза 10 до пятого. Чтобы правильно координировать постановку личинок, желательно учитывать некоторую изменчивость во времени выращивания.
Кроме того, споры номера быстро увеличиваются, так что если вы не обнаруживаете споры, просто попробуйте еще раз на следующий день. Удачи.
