Edhazardia aedis è un parassita microsporidiano che infetta specificamente le zanzare Aedes aegypti. Allevare questo parassita può essere una sfida per i nuovi ricercatori a causa della complessità del ciclo di vita del parassita. Questo protocollo fornisce istruzioni step-wise per l'allevamento di E.aedis, tra cui come programmare correttamente i passaggi alla procedura, identificare le spore infettive e propagare la prossima generazione di parassiti.
La tempistica accurata di questo protocollo può essere impegnativa e potrebbe richiedere alcune prove ed errori. Identificare le spore può anche essere difficile. Gli ausili visivi di questo protocollo dovrebbero fornire assistenza.
Per iniziare, schiudere le uova A.Aegypti infettate da E.aedis posizionandole in un vassoio di allevamento larvale con un litro di acqua deionizzata e aggiungendo 50 milligrammi di cibo per pesci. Ospita le zanzare a 27 gradi Celsius e all'80% di umidità relativa con un ciclo buio leggero di 14 ore e 10 ore. Dopo la schiusa, ridurre la densità delle larve a circa 100 larve per vassoio, rendendo nuovi vassoi se necessario.
Aggiungere un pezzo di cibo secco per gatti a ogni vassoio. Reintegrare il cibo quando è esaurito ma non fornire cibo in eccesso. Un pezzo di cibo per gatti da 200 milligrammi ogni tre giorni è sufficiente.
Quando le larve infette sono da terza a quarta stella, schiudere le uova A.aegypti non infette in un nuovo vassoio. Alleva le zanzare a densità tali che gli A.aegypti sani raggiungono il secondo al terzo instar in 48-72 ore. La schiusa di lotti di uova sane per più giorni può garantire che le larve siano nella fase corretta quando necessario.
Per raccogliere e quantificare spore uninucleate, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare 10 larve di quarta stella infetta in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Rimuovere l'acqua riproduttiva con una pipetta di trasferimento e lavare le larve una volta aggiungendo circa un millilitro di acqua deionizzata pulita. Rimuovere l'acqua di lavaggio e aggiungere 500 microlitri di acqua deionizzata pulita alle 10 larve e omogeneizzarli usando un pestello e un omogeneizzatore meccanico.
Caricare 10 microlitri di omogeneato su un emocitometro e quantificare le spore con ingrandimento 400X. Fai un liquame alimentare larvale fresco mescolando 1,2 grammi di polvere di fegato, 0,8 grammi di lievito di birra e 100 millilitri di acqua. Trasferire da 100 secondi a terzi larve di A.aegypti sane in becher da 150 millilitri o tazze campione e aggiungere cinque volte 10 alla quarta a una per 10 alla quinta spore a ogni tazza con una pipetta.
Aggiungere due millilitri di liquami di cibo larvale e acqua deionizzata per un volume finale di 100 millilitri. Dopo 12-24 ore di esposizione, trasferire le larve in vassoi di allevamento. Aggiungi cibo e allevali all'età adulta.
Monitorare le larve dosate per la pupa e trasferire le pupe in una tazza di emergenza in una gabbia. Lo zucchero nutre gli adulti ad libitum. Nutrire il sangue gli adulti secondo i protocolli standard disponibili attraverso le risorse BEI.
Raccogli le uova dagli adulti nutriti con sangue. La trasmissione verticale di E.aedis avviene in questo passaggio. Al termine, pulire tutti i materiali che sono venuti a contatto con E.aedis con candeggina al 10% e autoclave per prevenire la contaminazione.
Questo protocollo dimostra la procedura completa necessaria per propagare E.aedis nelle zanzare A.aegypti. Le uova di A.aegypti infettate da E.aedis sono state schiuse e le larve sono state allevate al quarto stadio instar. Nella quarta fase instar, potrebbero essere osservati segni visivi di infezione come sporocsti bianchi in tutti i corpi grassi delle larve infette.
Le spore uninucleate sono state raccolte da quarta larva instar omogeneizzando 10 larve in 500 microlitri di acqua deionizzata. Queste spore erano piriformi e facilmente visibili con ingrandimento 400X. È stato calcolato un conteggio delle spore di 4.050 spore per microlitro e queste spore sono state utilizzate per infettare larve sane attraverso la trasmissione orizzontale.
Lo stato di infezione e i carichi di E.aedis di 25 larve di generazione filiale sono stati valutati a sette giorni dopo la schiusa. Il tasso di infezione verticale di E.aedis nella generazione filiale è stato riscontrato essere del 96% e il carico medio di spore di individui infetti a sette giorni dopo la schiusa è stato 3,31 per 10 al quinto. Per coordinare correttamente la stadiazione larvale, è consigliabile tenere conto di una certa variabilità nel tempo di allevamento.
Inoltre, il numero di spore aumenta rapidamente, quindi se non rilevi spore, riprova il giorno successivo. Buona Fortuna.
