Подготовка одноклеточной или одной подвески ядер является критическим шагом для высокой пропускной способности транскриптома и эпигеномного профилирования. Наш протокол обеспечивает простой, воспроизводимый и универсальный метод изоляции одного ядра. В отличие от других методов, требующих моющего средства для изоляции ядер, наш протокол основан на колонке, которая является моющим средством и без ферментов.
Это позволяет ядер изоляции менее чем за 30 минут. Наш протокол упрощает изоляцию ядер. Он обеспечивает надежный метод подготовки одноядерной суспензии от трудноотмеченных и диссоциативных тканей.
Для начала, предварительно охладить буфер А и В из моющего средства, свободного от нукле изоляции комплект, поместив их на лед, по крайней мере 30 минут. Пальто трубки и пипетки советы с 5%BSA раствор, который будет способствовать восстановлению ядер. Чтобы покрыть кончики пипетки, пипетка 5%BSA раствор два-три раза и воздух высушить их в течение двух часов.
Чтобы покрыть трубки, заполнить их с BSA и инвертировать их три раза. Удалите раствор и высушите трубки вверх ногами на чистой бумаге ткани в течение двух часов. Пальто одной трубки коллекции и 1 1,5 миллилитров трубки на образец.
Используйте типсы, чтобы аккуратно разбить череп и удалить мягкие ткани, кожу и кости с брюшной и спинной сторон черепа. Затем аккуратно перенесите мозг в 30-миллиметровую тарелку, содержащую ледяной PBS, и измельчите мозг на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы. Чтобы изолировать одно ядра, перенесите рубленую ткань на фильтрованный картридж, предусмотренный в изоляционные установки ядер, и удалите лишний раствор и добавьте 200 микролитров холодного буфера A.Grind ткани с помощью пластикового стержня в течение двух минут.
Добавьте 300 микролитров холодного буфера А в картридж фильтра и инкубировать его на льду с крышкой, открытой в течение 10 минут. Затем крышка картриджа и повторного перерасхода ткани путем инвертирования трубки пять раз. Центрифуга образца трубки на 16000 раз г в течение 30 секунд, чтобы разорвать клетки.
Поток через содержит нетронутые ядра, которые образуют бесцветные гранулы в нижней части трубки. Откажитесь от фильтра, а затем повторно гранулы вихрем энергично в течение 10 секунд. Пеллет ядра снова центрифугирования раствора в 500 раз г в течение трех минут.
Затем осторожно отбросьте супернатант. Повторное производство гранул в 0,8 миллилитров холодного буфера B путем трубы два-три раза и центрифуги ядра в 600 раз g в течение 10 минут, что отделит их от мембранного мусора. Осторожно отбросьте супернатант.
Повторное распределение изолированных ядер в 500 микролитров PBS с 5%BSA и держать подвеску на льду до FACS. Чтобы подтвердить ядерную морфологию с окрашивание HEX, перенесите 100 микролитров подвески одного ядра в новую трубку с помощью наконечников с покрытием BSA. Окрашивайте ядра, добавляя 0,1 микролитер HEX и аккуратно вихревые трубки.
Перенесите подвеску ядер на стеклянную нижнюю тарелку и изображение ядер с помощью флуоресцентного микроскопа с лазерной установкой возбуждения 405 нанометров. Перед выполнением FACS, фильтровать ядра с 40 микрометровых клеток ситечко в трубку с покрытием BSA. Разбавить отфильтрованную подвеску, добавив PBS с 5%BSA до конечного объема 1000 микролитров.
Этикетка два круглых нижних facS труб, как контроль и окрашенных и передачи 250 микролитров подвески ядер в контрольную трубку с использованием BSA покрытием пипетки отзыв. Перенесите оставшиеся 750 микролитров раствора в трубку FACS с маркировкой окрашенные и добавьте один микролитер красителя HEX, чтобы испачкать ядра. Затем смешайте его медленным вихрем.
Загрузите неоплитый образец управления в сортер ячейки и завемит 5 000 событий. Затем загрузите окрашенный образец и замитите 5000 событий. Нарисуйте ворота FACS для идентификации одного ядра.
Ядра могут быть выбраны путем сравнения HEX флуоресцентный сигнал между контролем и окрашенных образцов. Затем сортировать HEX положительные ядра из окрашенных трубки в новую 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 50 микролитров PBS с 5%BSA. Этот протокол был использован для генерации одного ядра подвески непосредственно из ткани мозга зебры.
Изолированные ядра были окрашены HEX и визуализированы с помощью микроскопии флуоресценции. Они казались нетронутыми, круглыми и хорошо разделенными. Важно отметить, что ядерная агрегация отсутствовала.
Обогащение изолированных ядер было выполнено с цитометрией потока путем gating на присутствии HEX флуоресцентный сигнал. Неоближенные ядра отображали фоновую флуоресценцию, в то время как окрашенные ядра демонстрировали сильный сигнал флуоресценции. Неокрашиваемые и окрашенные ядра были хорошо сегрегированы в фиолетовом канале.
При попытке этого протокола, важно помнить, что одно ядра, как правило, придерживаться пластикового материала. Для предотвращения потенциальной потери ядер и повышения эффективности настоятельно рекомендуется базовое покрытие из пластикового материала. Изолированная подвеска одного ядра может быть дополнительно использована для одиночных ядер РНК Этот метод разъясняет клеточную неоднородность в сложных биологических системах и помогает определить подтипы клеток и генные сети.
Использование моющего средства и без ферментов метод регистрирует технический шум и предвзятость, введенные во время подготовки образца. Этот метод разработал упрощенную и логистическую изоляцию одного ядра.
