Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области жировой биологии, такие как, как межклеточные взаимодействия и физиология жировой ткани меняются при различных метаболических условиях, таких как пост и ожирение. Основным преимуществом этого метода является то, что он оптимально сохраняет оригинальную жировую 3D структуру и избегает длительных этапов обработки, которые обычно необходимы для обычной иммуногистохимии. Хотя этот метод может обеспечить понимание структуры жировой ткани, он также может быть применен к другим системам органов, таких как нервная система, путем цельного монтажа окрашивания мозга.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за трудностей в получении свойств тканей сайтов, найти надлежащий период фиксации, и оптимальные концентрации антител. После того, как вскрытие завершено, перенесите блюдо, содержащее образцы тканей в 1%paraformaldehyde от льда к комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите ткани либо в 12 или 24-хорошо клеточной культуры пластины для более быстрого мытья.
Важно помнить, что процедура окрашивания вся должна начинаться сразу после вскрытия и что между каждым шагом нет точек паузы. Вымойте ткани с PBS-0.3T на шейкер наклонен на 22 градусов со скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
После этого добавьте примерно 0,5 к одному миллилитру блокирующего буфера, содержащего 5%животной сыворотки. Инкубировать пластину на шейкере, используя предыдущие условия в течение одного часа. Аспирировать блокирующий раствор, и добавить на миллилитр первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1%животной сыворотки к каждому хорошо.
Инкубировать пластину на ночь на шейкере при четырех градусах по Цельсию с наклоном 22 градусов и скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту. На следующий день используйте PBS-0.3T для мытья тканей при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра соответствующих и разбавленных вторичных антител решений для каждой хорошо. Оберните пластину в алюминиевую фольгу и инкубировать его на шейкер при комнатной температуре в течение одного часа. После этого, мыть пластину дважды с PBS-0.3T при комнатной температуре в течение пяти минут за стирку.
Если визуализация жидких капель необходима во время нейтрального липидного пятна, мыть дважды с 1x PBS с каждой стирки продолжительностью пять минут. Добавить нейтральное липидное пятно, разбавленное в PBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы начать визуализацию, используйте типсы, чтобы заложить ткань плоской на 24 на 60 миллиметров стеклянной крышкой скольжения.
Если необходимо окрашивание ядер DAPI, добавьте одну-две капли монтажной среды, которая содержит DAPI, чтобы полностью погрузить ткань и предотвратить ее высыхание. Затем поместите слайд на перевернутую систему конфокального лазерного микроскопа. Для получения изображений цельно-монтируемых окрашенных тканей на нескольких фокусных плоскостях выполните стеки от 100 до 150 микрометров в глубину с размером шага от четырех до шести микрометров при желаемом увеличении.
В этом исследовании, цельно-монтажное окрашивание используется для сохранения архитектуры жировой ткани. В отличие от методов, которые включают в себя несколько этапов обработки и секций, которые могут привести к обезображиванию морфологии жировой ткани, цельно-монтажный метод окрашивания может сохранить морфологию адипоцитов, обеспечивая точность при интерпретации результатов. Перефиксация жировой ткани приводит к фиксации индуцированной флуоресценции, которая может быть указана перекрывающихся идентичных регионах, таких как гидроксилазы тирозина и PECAM-1 сигналы видели здесь.
Правильно фиксированные, цельно-монтажные образцы пятен, однако, показывают отдельные и четкие сигналы, указывающие на то, что эти сигналы не являются аутофторесценцией. Изображение цельно-монтажной жировой ткани позволяет количественно оценить морфологические изменения в различных экспериментальных условиях. В частности, жировая ткань высоко васкуляризирована, что важно при посредничестве метаболического гомеостаза при быстрых изменениях энергетического уровня.
Например, C57 черные мыши 6J, которые проходят 24 часов поста, отображают значительно меньший размер адипоцитов, что указывает на липолиз, и тенденция в повышенной плотности кровеносных сосудов по сравнению с постоянно кормили мышей. Очистка жировых тканей с помощью iDISCO позволяет жировой ткани стать оптически прозрачными. Иммунолабелирование жировой ткани, которая прошла через очистку тканей показывает гораздо плотнее нейронной арборизации по сравнению с тем, что наблюдается в цельно-монтажного окрашивания без очистки тканей при том же увеличении.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы не перефиксированы образцы в течение более часа при комнатной температуре в PFA, в противном случае, это увеличит фон аутофторесценции. Однако этот период фиксации может быть продлен, если образцы фиксируются при четырех градусах Цельсия. После этой процедуры, другие методы, такие как количественная оценка с помощью ImageJ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как, например, клеточной архитектуры, такие как адипоциты сайтов и плотность кровеносных сосудов, изменения в ответ на различные физиологические условия.
