Глутатион S-трансферазы, ГСТ, метаболические ферменты, которые ухудшают внутриклеточных электрофильных соединений и взаимодействуют с MAP киназы, участвующие в апоптоз пути. Поскольку эти две роли выражения GST коррелируют с лекарственной устойчивостью, решением противодействия этой проблеме является использование ферментативных ингибиторов. С помощью этого протокола мы предоставляем способ тестирования таких молекул.
Этот метод предназначен для всех новых в области ингибиторов GST, которые хотят использовать быстрый и простой метод для изучения взаимодействия фермента-соединения. Мы также предоставляем шаги, чтобы определить две характеристики ингибитора, ингибирующая концентрация 50, IC50, и константа ингибирования, Ki.As хорошо мы описали технику для определения способа торможения, важная особенность, которая имеет различные биологические последствия. Первым шагом является определение энзиматической активности GST в решении на единицу.
Одна единица на мил — это объем фермента, необходимого для синтеза одного микромолара продукта в минуту. Количественная оценка концентрации белка ферментного раствора. Выберите технику в соответствии с вашим удобством.
Разбавить белковый раствор до конечной концентрации 0,02 миллиграмма на мил в воде. Держите энзиматический раствор на льду. Подготовь реакцию в пластине из 96 колодец.
Добавьте 20 микролитров воды для пустых колодцев. Добавьте 20 микролитров энзиматического раствора для испытательных скважин. Добавьте 20 микролитров GSH.
Добавьте 150 микролитров PBS. Добавьте 10 микролитров CDNB по 50 миллимоляров в каждую колодец. Смешайте тарелку на шейкере в течение нескольких секунд.
С помощью спектрофотометрического считыватель пластины, запись поглощения на 340 нанометров каждую минуту в течение 10 минут. Проанализируйте результаты в электронной таблице и с помощью специализированного программного обеспечения. Согласно полученным результатам, подготовь решение по запасу GST на уровне 0,1 единицы на мил в воде.
Подготовь шесть различных концентраций CDNB 20 раз в 95% этанола в окончательном объеме 200 микролитров. В каждый колодец добавьте 20 микролитров GSH при 25 миллимолярах. К испытательным скважинам добавьте 20 микролитров GST по 0,1 единицы на миллион.
К пустым колодцам добавьте 20 микролитров воды. В каждый колодец добавьте 150 микролитров PBS. К испытательным скважинам и пустым скважинам добавьте 10 микролитров соответствующего раствора CDNB.
Каждая концентрация CDNB нуждается в определенном пробеле. Смешайте содержимое на шейкере в течение нескольких секунд, завещайте абсорбанс на 340 нанометров каждую минуту в течение 10 минут. Проанализируйте результаты с помощью специализированного программного обеспечения.
Определите км, нарисовав сюжет Михаэлиса-Ментена. Согласно результатам, подготовить решение CDNB в 20 раз больше полученного км в 95%этанола. Разбавить раствор ингибитора до необходимой концентрации.
В пластине из 96 колодец добавьте два микролитров потенциального ингибитора GST. К пустым колодцам добавьте два микролитров развихи. Добавьте 20 микролитров GSH на 25 миллимоляров в каждую колодец и 168 микролитров PBS.
Добавьте 10 микролитров CDNB 20 раз км, найденных на предыдущем этапе. Смешайте тарелку на шейкере в течение нескольких секунд. Запись поглощения на 340 нанометров каждую минуту в течение 10 минут.
Проанализируйте результаты с помощью специализированного программного обеспечения. Согласно результатам, один и тот же пробел может быть использован для каждого ингибитора GST или должен быть скорректирован. Подготовь девять концентраций испытанного ингибитора GST.
Подготовь решение эссе, состоящее из 148 микролитров PBS и 20 микролитров GSH при 25 наномолярных для одной реакции. Хорошо перемешать раствор. Для испытательных скважин добавьте два микролитров ингибитора GST, 20 микролитров GST, 0,1 единицы на мил и 168 микролитров раствора анализа.
Для контрольных скважин добавьте два микролитера разжителя, используемого для ингибитора GST, 20 микролитров GST 0,1 единицы на мил и 168 микролитров раствора анализа. Для пустых колодцев добавьте два микролитров разжиеня, используемых для ингибитора GST, 20 микролитров воды и 168 микролитров раствора анализа. Добавьте 10 микролитров решения CDNB для каждой колодец, включая пробел.
Смешайте на шейкере в течение нескольких секунд. Запись поглощения на 340 нанометров каждую минуту в течение 10 минут. Рассчитайте IC50 со специализированным программным обеспечением.
Подготовка четырех решений CDNB в различных концентрациях, как это объясняется в протоколе. Подготовьте три решения ингибитора GST в различных концентрациях, также как поясняется в протоколе. Подготовь для одной реакции энзиматические растворы, содержащие 148 микролитров PBS и 20 микролитров GSH при 25 миллимолярах.
Для контрольных скважин добавьте два микролитров разивления, используемого для ингибитора GST. А для испытательных и пустых скважин два микролитера правильного ингибиторного раствора GST. Смешайте в течение нескольких секунд.
Добавьте к каждой колодец 168 микролитров энзиматического раствора. Добавьте 10 микролитров соответствующих концентраций CDNB в каждую соответствующую хорошо. Смешайте в течение нескольких секунд, а затем записать поглощение на 340 нанометров каждую минуту в течение 10 минут.
Повторите эксперимент с использованием одного и того же шаблона покрытия для использования четырех различных концентраций CDNB вдоль трех различных концентраций ингибитора GST. Анализ результатов с помощью специализированного программного обеспечения для определения способа ингибирования, а также Ki.This протокол был применен к куркумин, молекула с противораковыми свойствами. Это соединение было выбрано путем вычислительных прогнозов связывающей близости для нескольких изоформ GST.
Параллельно проводились те же эксперименты на этикриновой кислоте, наиболее широко используемом ингибиторе GST в лабораторной среде в качестве положительного контроля. Ингибирующая потенция была протестирована на пуле ГТС из конной печени и может быть применена к любым GST изоформам выбора. Были определены IC 50, а также тип торможения и Ki.
Для того, чтобы обеспечить наилучшие условия анализа, во-первых, Michaelis-Menten постоянной, Км субстрата CDNB с пулом GSTs был определен. Км является представителем сродства между субстратом и ферментом. Определение этого значения имеет решающее значение для того, чтобы использовать не насыщающих концентрации для эссе.
На самом деле, две высокие концентрации могут поставить в невыгодное положение конкурентоспособные ингибиторы, в то время как слишком малое количество не будет обнаружено. Пожалуйста, смотрите тексты для получения более подробной информации по этому вопросу. Для этого эксперимента было использовано шесть различных концентраций CDNB с фиксированной концентрацией ферментов GSH и GST.
График Михаэлиса-Ментена был получен путем построения концентрации субстрата в миллимолярах на оси Х и скорости в миллимолярах в минутах на оси Y. Скорость реакции была рассчитана с уравнением 1. Км определяется как половина Vmax, значение, полученное после насыщения раствора субстратом для того, чтобы получить плато конъюгации формирования.
Км CDNB для протестированного энзиматичного решения GST был определен как 0,26 миллимолара на основе расчетов со специализированным программным обеспечением. IC50 определяется как концентрация вещества, необходимого для ингибирования активности фермента в два раза. IC50 оценивался с помощью нелинейного регрессионного графика, на котором логаритмическая концентрация ингибитора GST была построена на ось x и процент активности GST на оси Y.
Было использовано девять различных концентраций ингибитора. Деятельность GST определялась с применением уравнения 1. Результаты были нормализованы с помощью контроля без ингибитора.
Куркумин плохо растворяется в воде. Таким образом, более высокие концентрации не удалось использовать, что затрудняет получение максимального торможения. Тем не менее, специализированное программное обеспечение было в состоянии предсказать IC50 учебной программы для этого пула GST на значение 31,4 микромоляра.
Параллельно был проведен тот же эксперимент с этикриновой кислотой в качестве положительного контроля. Как и ожидалось, эта молекула была подтверждена в качестве ингибитора GST с IC50 из 6,7 микромоляра. Эти результаты подтвердили, что куркумин также является ингибитором GST с IC50 в микромолярном диапазоне, похожим на этакриновую кислоту.
Для более детального изучения куркумина как ингибитора GST был определен тип ингибирования, а также константа ингибирования, Ки. Во-первых, тип ингибирования оценивался с помощью графиков Михаэлиса-Ментена. Используя различные концентрации субстрата CDNB при одновременном увеличении концентраций ингибитора GST, км значительно увеличился в корреляции с концентрациями куркумина, в то время как Vmax остался неизменным, несмотря на различные условия.
Этот режим торможения характерен для конкурентного режима торможения. Для получения более подробной информации о других видах запретов, пожалуйста, обратитесь к тексту. Ki был рассчитан соответственно на основе типа ингибирования с использованием того же набора данных, обеспечивая значение 23,3 микромолара куркумина.
Объясненные методы являются основными энзиматических эссе, которые требуют тщательности через определенные шаги для того, чтобы обеспечить правильные и воспроизводимые результаты. Определение постоянного км Михаэлиса-Ментена, которое разграничивает близость субстрата к ферменту, является одним из важнейших шагов. В самом деле, когда концентрация субстрата слишком высока или слишком низка, это затрудняет определение правильного способа торможения и Ki не правильно рассчитаны.
Эта процедура может быть применена к рекомбинантным ГСТ человека, как пример GSTA1 и один из P1, используются в исследованиях клеточной культуры для оценки потенциала, который будет использоваться в сочетании с электрофилическими агентами для снижения лекарственной устойчивости.
