Glutatión S-transferasas, GSTs, son enzimas metabólicas que degradan los compuestos electrofílicos intracelulares e interactúan con las quinasas MAP implicadas en la vía de la apoptosis. Debido a que estos dos roles de expresión de GST están correlacionados con la resistencia a los medicamentos, una solución para contrarrestar este problema es utilizar inhibidores enzimáticos. Con este protocolo, proporcionamos una manera de probar tales moléculas.
Este método está dirigido a todos los nuevos en el campo de los inhibidores del GST, que desean utilizar un método rápido y fácil para examinar la interacción enzima-compuesto. También proporcionamos los pasos para determinar dos características de un inhibidor, la concentración inhibitora 50, IC50, y la constante de inhibición, Ki.As bien describimos la técnica para definir el modo de inhibición, una característica importante que tiene diferentes consecuencias biológicas. El primer paso es determinar la actividad enzimática del GST en solución por unidad.
Una unidad por mil es el volumen de enzima necesario para sintetizar un micromolar de producto por minuto. Cuantificar la concentración proteica de la solución enzimática. Elija la técnica de acuerdo a su conveniencia.
Diluir la solución proteica a una concentración final de 0,02 miligramos por mil en agua. Mantenga la solución enzimática en hielo. Prepare la reacción en una placa de 96 pozos.
Agregue 20 microlitros de agua para los pozos en blanco. Añadir 20 microlitros de la solución enzimática para los pozos de prueba. Añadir 20 microlitros de GSH.
Añadir 150 microlitros de PBS. Añadir 10 microlitros de CDNB a 50 mililitros en cada pozo. Mezcle la placa en una coctelera durante unos segundos.
Con un lector de placas espectrofotométricas, registre la absorbancia a 340 nanómetros cada minuto durante 10 minutos. Analizar los resultados en una hoja de cálculo y con un software especializado. De acuerdo con los resultados obtenidos, preparar una solución de GST en 0,1 unidades por mil en agua.
Preparar seis concentraciones diferentes de CDNB 20 veces en 95% etanol en un volumen final de 200 microlitros. En cada pozo, añadir 20 microlitros de GSH a 25 milimolar. A los pozos de prueba, agregue 20 microlitros del GST a 0,1 unidad por mil.
A los pozos en blanco, agregue 20 microlitros de agua. En cada pozo, agregue 150 microlitros de PBS. A los pozos de prueba y a los pozos en blanco, agregue 10 microlitros de la solución CDNB correspondiente.
Cada concentración de CDNB necesita un espacio en blanco específico. Mezclar el contenido en una coctelera durante unos segundos, registrar la absorbancia a 340 nanómetros cada minuto durante 10 minutos. Analizar los resultados con un software especializado.
Determine el Km dibujando un trazado Michaelis-Menten. De acuerdo con los resultados, preparar una solución CDNB a 20 veces el Km obtenido en 95%etanol. Diluir la solución del inhibidor a la concentración requerida.
En una placa de 96 pozos, agregue dos microlitros del posible inhibidor del GST. A los pozos en blanco, agregue dos microlitros del diluyente. Añadir 20 microlitros de GSH a 25 milivolares en cada pozo y 168 microlitros de PBS.
Añadir 10 microlitros de CDNB 20 veces Km encontrados durante el paso anterior. Mezcle la placa en una coctelera durante unos segundos. Registre la absorbancia a 340 nanómetros cada minuto durante 10 minutos.
Analizar los resultados con un software especializado. Según los resultados, el mismo espacio en blanco se puede utilizar para cada inhibidor de GST o debe ajustarse. Preparar nueve concentraciones del inhibidor del GST probado.
Preparar la solución de ensayo que consta de 148 microlitros de PBS y 20 microlitros de GSH a 25 nanomolares para una reacción. Mezclar bien de la solución. Para los pozos de prueba, agregue dos microlitros de inhibidores de GST, 20 microlitros de GST, 0,1 unidad por mil y 168 microlitros de la solución de ensayo.
Para los pozos de control, agregue dos microlitros del diluyente utilizado para el inhibidor de GST, 20 microlitros de GST 0,1 unidad por mil y 168 microlitros de la solución de ensayo. Para los pozos en blanco, añadir dos microlitros del diluyente utilizado para el inhibidor GST, 20 microlitros de agua y 168 microlitros de la solución de ensayo. Agregue 10 microlitros de la solución CDNB para cada pozo, incluido el espacio en blanco.
Mezcle en la coctelera durante unos segundos. Registre la absorbancia a 340 nanómetros cada minuto durante 10 minutos. Calcular el IC50 con un software especializado.
Preparar cuatro soluciones CDNB a diferentes concentraciones como se explica en el protocolo. Preparar tres soluciones inhibidoras del GST en diferentes concentraciones, también como se explica en el protocolo. Preparar las soluciones enzimáticas que contienen 148 microlitros de PBS y 20 microlitros de GSH a 25 mililitros para una reacción.
Para los pozos de control, añadir dos microlitros del diluyente utilizado para el inhibidor de GST. Y para los pozos de prueba y en blanco, dos microlitros de la solución correcta inhibidora del GST. Mezclar durante unos segundos.
Añadir 168 microlitros de la solución enzimática a cada pozo. Añadir 10 microlitros de las concentraciones de CDNB correspondientes en cada pozo respectivo. Mezclar durante unos segundos, luego registrar la absorbancia a 340 nanómetros cada minuto durante 10 minutos.
Repita el experimento utilizando el mismo patrón de chapado para utilizar las cuatro concentraciones diferentes de CDNB a lo largo de las tres concentraciones diferentes de inhibidor de GST. Analizar los resultados con un software especializado para determinar el modo de inhibición, así como el Protocolo Ki.This se aplicó a la curcumina, una molécula con propiedades anticancerígenas. Este compuesto fue seleccionado por predicciones computacionales de la afinidad de enlace para varias isoformas GST.
Paralelamente, se llevaron a cabo los mismos experimentos con ácido etacrílico, el inhibidor de GST más utilizado en el entorno de laboratorio como control positivo. La potencia inhibitoria se probó en un grupo de GST del hígado equino y se puede aplicar a cualquier isoforma de GST de elección. Se determinaron el IC 50, así como el tipo de inhibición y el Ki.
Con el fin de proporcionar las mejores condiciones de ensayo, en primer lugar, se determinó la constante Michaelis-Menten, Km del sustrato CDNB con un conjunto de GST. Km es representativo de la afinidad entre el sustrato y la enzima. La determinación de este valor es crucial para utilizar una concentración no saturadora para el ensayo.
De hecho, dos concentraciones altas podrían perjudicar a los inhibidores de la competencia, mientras que una cantidad muy pequeña no será detectable. Consulte los textos para obtener más detalles al respecto. Para este experimento, se utilizaron seis concentraciones diferentes de CDNB con una concentración fija de enzimas GSH y GST.
El gráfico Michaelis-Menten se obtuvo trazando las concentraciones de sustrato en milimolar en el eje X y la velocidad en milimolar por minuto en el eje Y. La velocidad de la reacción se calculó con la ecuación uno. Km se determina como medio Vmax, un valor obtenido después de la saturación de la solución con el sustrato con el fin de obtener una meseta de formación conjugada.
El Km de CDNB para la solución enzimática GST probada se determinó como 0,26 milimolar basado en cálculos con un software especializado. IC50 se define como la concentración de sustancia necesaria para inhibir la actividad enzimática a la mitad. IC50 se estimó utilizando un gráfico de regresión no lineal donde la concentración logarítmica del inhibidor GST se trazaba en el eje X y el porcentaje de actividad de GST en el eje Y.
Se utilizaron nueve concentraciones diferentes de inhibidores. La actividad del GST se determinó con la aplicación de la ecuación uno. Los resultados se normalizaron utilizando el control sin inhibidor.
La curcumina es poco soluble en agua. Por lo tanto, las concentraciones más altas no eran posibles de usar, lo que dificultaba la obtención de la máxima inhibición. Sin embargo, un software especializado fue capaz de predecir el IC50 del currículo para este conjunto de GST a un valor de 31,4 micromolares.
Paralelamente, el mismo experimento se llevó a cabo con ácido etacrílico como un control positivo. Como era de esperar, esta molécula fue confirmada como un inhibidor del GST con un IC50 de 6.7 micromolares. Estos resultados confirmaron que la curcumina es así un inhibidor del GST con un IC50 en el rango micromolar, similar al ácido etacrínico.
Para estudiar más en detalle la curcumina como un inhibidor de GST, el tipo de inhibición, así como la constante de inhibición, Ki, se determinaron. En primer lugar, el tipo de inhibición se evaluó con los gráficos Michaelis-Menten. Mediante el uso de diferentes concentraciones del sustrato CDNB mientras aumentaba las concentraciones del inhibidor de GST, Kms aumentó significativamente en correlación con las concentraciones de curcumina mientras que Vmax se mantuvo sin cambios a pesar de las diversas condiciones.
Este modo de inhibición es típico de un modo competitivo de inhibición. Para obtener más detalles sobre los otros tipos de inhibiciones, consulte el texto. Ki se calculó en consecuencia sobre la base del tipo de inhibición utilizando el mismo conjunto de datos, proporcionando un valor de 23.3 micromolares de curcumina.
Los métodos explicados son ensayos enzimáticos básicos, que requieren cuidado a través de ciertos pasos con el fin de proporcionar resultados correctos y reproducibles. La determinación de la constante Michaelis-Menten Km, que delinea la afinidad del sustrato con la enzima es uno de los pasos cruciales. De hecho, cuando la concentración del sustrato es demasiado alta o demasiado baja, hace difícil identificar el modo correcto de inhibición y Ki no se calcula correctamente.
Este procedimiento se puede aplicar a los GST recombinantes humanos, como ejemplo GSTA1 y uno de P1, se utilizan en estudios de cultivo celular para evaluar el potencial que se utilizará en combinación con agentes electrofífilos para reducir la resistencia a los medicamentos.
