Этот метод предоставляет пошаговые инструкции о том, как получить индуцированные человеком плюрипотентные органоиды кишечника путем дифференцировки в дефинитивную энтодерму, затем эпителий задней кишки и, наконец, перенос в условия 3D-культивирования. Результаты, полученные с помощью индуцированных человеком плюрипотентных органоидов кишечника, полученных из стволовых клеток, демонстрируют большую переводимость, чем данные из одноклеточных культур, а также являются более практичными, чем первичные органоиды тканевого происхождения, которые может быть трудно хранить в культуре в течение длительного времени. После получения клеток кишечника человека из дифференцированных ИПСК используйте серологическую пипетку объемом 5 миллилитров, чтобы отделить клеточный монослой от каждой лунки 6-луночного планшета.
И объедините клетки в одну пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде кишечника, добавив факторы роста. И добавьте соответствующий объем внеклеточного матрикса в соответствии с количеством лунок, которые покрываются.
Добавьте 30 микролитров клеточной суспензии в центр соответствующего количества лунок 48-луночной пластины. Обеспечение того, чтобы ECM был размещен в центре лунки, очень важно для долгосрочной стабильности этого образца. Если ECM коснется стенки скважины, она может разрушиться и образцы могут быть потеряны.
Поместите планшет в инкубатор клеточных культур минимум на 5 минут. Когда внеклеточный матрикс схватится, добавьте в каждую лунку по 300 микролитров свежей кишечной питательной среды, дополненной факторами роста, и верните планшет в инкубатор клеточной культуры. Через 48 часов с помощью светового микроскопа проверьте лунки на наличие органоидов.
После 7 дней культивирования аспирируйте питательную среду и замените ее ледяной DPBS. Используйте серологическую пипетку объемом 5 миллилитров, чтобы механически отделить органоиды и сферу внеклеточного матрикса от планшета. Затем соберите органоиды в одну центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Соберите органоиды центрифугированием и аспирируйте надосадочную жидкость до верхней части видимого слоя ECM. Повторно суспендируйте гранулу в 15 миллилитрах ледяного DPBS и снова центрифугируйте ячейки. После аспирации надосадочной жидкости, как показано на рисунке, повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре ледяного PBS и используйте пипетку P200 для ручного разрушения неповрежденных органоидов.
Подтверждают полную диссоциацию органоидов. Раскрутите диссоциированные органоиды и повторно суспендируйте в необходимом объеме внеклеточного матрикса перед нанесением на новую 48-луночную пластину, как показано на рисунке. Затем верните тарелку в инкубатор на 5 минут.
Через 5 минут извлеките планшет из инкубатора и добавьте в кишечник базальную среду с факторами роста и ингибитором ROCK. Меняйте носитель каждые 2-4 дня. Чтобы вызвать воспалительную реакцию в органоидах кишечника, замените надосадочную жидкость в каждой лунке органоидной культуры 300 микролитрами свежеприготовленной базальной среды с добавлением 40 нанограммов на миллилитр TNF альфа.
Затем верните планшет в инкубатор клеточных культур на 48 часов, чтобы воспроизвести провоспалительную среду. Экспрессию генов можно отслеживать в ходе дифференцировки IPSC человека с помощью маркеров плюрипотентности, которые высоко экспрессируются на 0-й день и быстро снижаются в процессе окончательной дифференцировки энтодермы. На 2-й день дифференцировки должны начать экспрессироваться дефинитивные гены энтодермы, а пик экспрессии должен быть достигнут на 3-й день.
Во время спецификации заднего кишечника экспрессия CDX2 и HNF4alpha должна индуцироваться и увеличиваться с течением времени. Через 48 часов после переноса 2D-листов клеток листы клеток должны начать самоорганизовываться в более компактные 3D-сфероидные структуры, которые изначально небольшие, но постепенно увеличиваются в размерах и сложности в течение следующих 7-10 дней культивирования. Органоиды не следует пассировать до тех пор, пока они не достигнут четкой морфологии сфероида органоида с явным эпителием и просветом, обращенным к центру структуры.
Когда структуры достигают этой стадии, может быть проведена иммуноцитохимия для подтверждения экспрессии кишечных маркеров, таких как виллин и CDX2. Для моделирования воспаления TNF альфа может быть добавлен в культуральную среду тканей в течение 24-48 часов, что обычно приводит к экспрессии провоспалительных маркеров в сочетании с подавлением эпителиальных маркеров кишечника. Индуцированные человеком плюрипотентные органоиды кишечника, полученные из стволовых клеток, могут быть использованы для разработки лекарств, моделирования заболеваний, редактирования генов, изучения микроокружения опухоли, а также транскриптомного, протеомного и эпигенетического профиля любого интересующего заболевания.
Этот метод может помочь многим лабораториям установить кишечные органоиды в качестве модельной системы, предоставляя им дополнительный метод для их исследований.
